主题:【第十二届原创】基于C、O稳定同位素及矿质元素对中国葡萄酒的地理分类

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10月二等奖 年度二等奖

基于C、O稳定同位素及矿质元素对中国葡萄酒的地理分类


    摘要:葡萄酒质量的高低较大程度受风土影响,形成了不同区域特征。为规避葡萄酒市场掺假、混淆产地的风险,有效鉴别中国葡萄酒产区,利用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)、液相色谱同位素质谱仪(LC-IRMS)及同位素质谱仪(EQ-IRMS)分别对样品中的矿质元素、碳同位素比和氧同位素比进行测定。收集中国五个产区142个(新疆、宁夏贺兰山、云川藏、延怀河谷、河西走廊)发酵罐中酒样,保证实验样品具有产地真实属性。结合方差分析(ANOVA)、主成分分析(PCA)、聚类分析(CA)、及线性判别分析(LDA)对五个地区葡萄酒进行分类,结果表明,32种元素在不同产地有显著差异,提取8个主成分,累计贡献率达80.06%,逐步判别分析筛选出Li、Mo、Ag、Mg、Ir、Th、Ta、Re、Pt、水氧元素,建立判别模型,模型对原样品分类正确率达90.8%,交叉分析对模型检验正确率达87.3%。乙醇碳相对稳定,单独使用时不能区分产地,结合矿质元素、甘油碳、葡萄酒水中氧使鉴别效果更好。
    关键词:碳同位素;氧同位素;多元素分析;产地鉴别;中国葡萄酒
Abstract:Thequality of wine is greatly affected by the climate, thus forming differentregional characteristics. In order to avoid the adulteration of the wine market,the risk of the fraud of production place, and effectively identify the realorigin place in China, we used inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS), Liquid chromatography isotope mass spectrometry (LC-IRMS) and isotopemass spectrometer (IRMS) to determine elemental profile, carbon isotope ratio (δ13C),and oxygen isotope ratio (δ18O) in samples, respectively. Wecollected the wine samples from the fermenters in five production areas inChina (Ningxia Helan Mountain, Xinjiang, Yunchuanzang, Yanhuai valley, HexiCorridor) to ensure that the experimental samples have real properties. Basedon the concentration data of 58 elements and the ratio of carbon and oxygenisotopes, data were processed by the analysis of variance (ANOVA), principalcomponent analysis (PCA), cluster analysis (CA) and linear discriminantanalysis (LDA), the wines of five regions were classified. The results showedthat 32 elements were significantly different from different places (P<0.05).Eight principal components are extracted by the principal component analysis,and the cumulative contribution rate reached 80.06%. We have established adiscriminant function with ten elements, the classification accuracy rate oforiginal sample reached to 90.8%, and the correct analysis rate of the modelwas 87.3%. Ethanol δ13C was relatively stable, and can not bedistinguished from the place of origin when used alone. If this element can combinedwith elemental profile and δ18O, may be the identificationresult will be better.
Keywords:carbonisotope ratio; oxygen isotope ratio; multivariate analysis; originidentification; Chinese wine.
        葡萄酒是一种贯穿于人类历史中的重要酒精性饮品,以酒精度低,香气复杂,口感圆润等特点著称。葡萄酒中酒精和多酚类物质有助于抗氧化、调节脂质和抗炎的作用,并对高血压、心血管疾病、神经系统疾病等有保护性关联。经济高速发展不仅提高了人民的生活水平,同时也使食源性疾病频发,引起了人们对食品安全问题的重视。葡萄酒作为世界范围内广泛消费的酒精性饮品,具有较高的商业价值,其商业价值受葡萄品种、原料质量、酿造工艺、陈年过程等因素影响,具有一定区域特性。一些不法商贩以次充好,甚至外源添加乙醇、甘油、水来降低成本,非法谋取高额利润,扰乱葡萄酒市场秩序。近年来,中国葡萄酒市场日渐繁荣,葡萄种植面积、葡萄酒消费量和进口量都保持较高水平,国际葡萄与葡萄组织(OIV)2018年数据显示,中国葡萄种植面积位居世界第二;消费量位居世界第五大,约为246亿升;进口量和进口额分别位列世界第四、第五,中国葡萄酒市场发展迅猛且有更大发展潜力。我国已经形成葡萄酒地理标志产品保护,虽然已对其产地范围、产品质量及技术要求做了严格规定,但未提供相应的产地属性鉴别方法或快速、准确的葡萄酒产地鉴别技术。建立健全葡萄酒产地溯源机制既能有效把控葡萄酒质量,又能更好的表征同属性葡萄酒特点。
葡萄植株从土壤中吸收矿质元素,并随生长代谢,从而使得葡萄酒中的矿质元素与土壤特性相关,不同的气候条件、土壤类型使矿质元素被植物吸收程度不同,体现在不同产地葡萄酒中存在差异,进而可以作为产地溯源的有效工具。矿质元素分析方法已被多个国家成功运用在葡萄酒产地鉴别上,该方法通常与几种化学计量学手段相结合,如方差分析法(ANOVA)、主成分分析法(PCA)、线性判别法(LDA)、偏最小二乘分析(PLS)等。澳洲学者对1297份样品进行ICP-MS和ICP-AES测定得出葡萄酒多元成分基本与葡萄品种无关,但多元素组成在不同产地葡萄酒中有显著差异。Helene Hopfer等人对不同葡萄酒厂的葡萄酒元素组成的影响进行研究,结果表明在同一酒厂酿造葡萄酒时会表现出相同的元素组成模式,说明酿造工艺对葡萄酒元素有一定影响。OIV(国际葡萄与葡萄酒组织)已经初步建立葡萄酒同位素分析方法,其中包括检测非法加糖(OIV MA-AS-311-05、OIVMA-AS-312-06)、加水(OIV MA-AS2-12)、加甘油(OIV-MA-AS312-07),并实现地理可追溯性。法国、德国、意大利、美国、希腊等国家应用C、H、O同位素进行葡萄酒产地鉴别,均得到效果良好的分类率。葡萄酒中同位素C有多种存在形式,如葡萄糖、果糖、乙醇、甘油、丙三醇、乙酸、乳酸乙酯、2-甲基丁醇等中都含有C同位素。目前,乙醇δ13C、甘油δ13C在鉴别是否外源添加糖、乙醇的葡萄酒掺假鉴别中效果明显,也多与δ18O结果用于葡萄酒年份鉴定。FrançoisGuyon等人研究表明δ13C可以用来确定葡萄酒基质的真实性,认为真实葡萄酒的δ13C基本稳定,包括甘油碳和乙醇碳。B.Raco等人对41个意大利商品酒进行乙醇中的δ13C和葡萄酒水的δ2H、δ18O的测定,结果表明气候对δ18O影响较大,有利于判别气候差异较大产区和气候差异较大年份;乙醇中δ13C在一定范围内波动,但不能有效区分葡萄酒产地;δ2H在两年内不受温度和湿度的影响,认为该属性可以更好保证产地鉴别的准确性;最终得到结合C、H、O鉴别葡萄酒产地效果更佳的结论。Federica Camin等人研究发现δ18O受气候和地理影响较大,有较强的相关性。Elisabeta Irina Geana等人测定100个酒样的C、O同位素,得到相同结论。
        目前,葡萄酒产地鉴别研究存在使用样本量较少的现状,不同国家和地区存在很大差异,使建立葡萄酒产地数据库存在一定困难。相比于传统葡萄酒生产国家,我国葡萄酒产地鉴别仍在起步阶段,鉴定手段、鉴定时效性、制度监督等方面仍缺乏具体细节的落实。我国葡萄栽培面积广泛,气候土壤类型多样,使区分不同产区葡萄酒真实属性具有可行性。为探索我国葡萄酒产地属性鉴别的有效方法,保证样品具有原产地属性的前提下,本研究选择三个不同气候类型的五个产地,引入矿质元素、同位素甘油碳、同位素乙醇碳、葡萄酒水氧元素,建立判别模型,使用较多样本量和较少参数,更精确判别中国葡萄酒产地,同时为规范中国葡萄酒市场提供技术参考。
     

表1  原产地葡萄酒样品基本信息

 

Table 1 Basic information on  wine samples

 

                                                                                                               

   

Origin

   

Year

   

Number

   

HL

   

2011-2014

   

35

   

XJ

   

2009-2014

   

35

   

YCZ

   

1997-2014

   

36

   

YH

   

2012-2014

   

16

   

HX

   

2010-2014

   

20

 

 

of origin
                             



                          图1 中国五个葡萄酒产区位置
Fig.1 Location of five wine producing areas in China
2. 2。材料与方法
2.1样品准备
为保证样品具有产地真是属性,采集地理区域为中国重要葡萄酒产区,且样品均取自当地酒厂发酵罐中,葡萄品种均为酿酒品种,实验忽略品种、工艺及葡萄酒种类所产生的影响。为便于数据处理,对同一产区葡萄酒样品做统一代码标记:宁夏贺兰山产区(HL)、中国新疆产区(XJ)、云川藏产区(YCZ)、延怀河谷产区(YH)及河西走廊产区(HX),详细酒样信息见表1,产区具体位置见图1。
2.2.矿质元素分析
2.2.1材料及仪器
采用PerkinElmer ICP-MS Elan DRC-e 电感耦合等离子体质谱仪,配备40.68 MHz 自激式射频发生器、GemClean TM 十字交叉雾化器、Ryton TM 高分子惰性材料双通道雾化室(美国 Perkin Elmer 公司);Lab Tech EHD36 电热消解板(北京莱伯泰科仪器公司);微量移液器(德国Eppendorf 公司)。
MOS 级硝酸(北京化学试剂研究所);去离子水(18.2 MΩ·cm 美国Millipore公司);Ag、Al、As、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、Pb、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Ti、Tl、U、V和Zn 等58 种元素标准溶液(加拿大SCP SCICENCE公司,100 mg/L,介质为0.5 % HNO3/2% HCl/1 % HF)。
2.2.2湿法消解流程
精确量取5mL酒样于消解管中,置于80-90℃电热板上加热驱赶乙醇至2mL,冷却至室温后加入5 mL浓硝酸和2mL过氧化氢,再置于110-120℃电热板上蒸发至2 m,冷却至室温后转入容量瓶,用超纯水定容至25 mL,待测。
2.2.3ICP-MS测定条件
仪器预热后经调谐液优化仪器参数,射频功率:1100 W;等离子气流量15 L/min;载气流量:0.94 L/min;辅助器气流量:1.2L/min;透镜电压:5.5 V;雾化室温度:2℃;蠕动泵转速:0.1r/s;采样流量:0.8 m L/min;采样深度:8.0mm;仪器软件推荐校正方程外标法定量,以2%硝酸为介质,标准溶液以0.25ppb、0.5 ppb、1.0ppb、5.0 ppb、10.0ppb及50.0ppb的浓度绘制标准曲线,以10ppb标准溶液Y作为内标。
2.3稳定同位素C分析
仪器:液相色谱同位素质谱仪(LC-IRMS):美国ThermoFisher公司的DELTA VPlus 同位素质谱仪,配备Surveyor液相色谱与Isolink接口。硫酸、正磷酸(纯度≥99%)、过二硫酸钠(纯度≥99%)均购于 SigmaAlderich 公司,载气:氦气(纯度为99%),配制溶液存于棕色瓶内用前需使用超声波和真空过滤装置进行脱气。vodka乙醇标准样(浓度87.32%)δ13C值范围为-27.51-27.55
色谱条件、质谱条件及样品预处理:参考李学民方法,调整进样量,测定甘油碳进样体积为20μL,测定乙醇碳进样体积为5μL。选择相同色谱柱,将流动相流速调为0.3mL/min,氧化剂流速调为0.1mL/min。以vodka乙醇标准品稀释八倍为质控样,校正偏移结果。样品预处理稀释倍数选择100倍,其余条件均相同。
2.4稳定同位素O
采用同位素水平衡仪器(EQ-IRMS),来自英国Sorcon公司,对葡萄酒中O进行直接测定样品,将0.2mL添加到进样瓶中,用螺旋帽和硅胶模密封。将样品分组测定,用在相同瓶中以SMOW校准CO2参考气为指控,每组包含所需样品6个,样品前后各5个装有CO2参考气的进样瓶,起到给样品参考值和检测仪器稳定性的作用。测定样品前需进行CO2充气处理,同位素平衡反应时间的初步实验结果表明,在50℃保温状态下平衡状态至少在12小时后出现,反应环境温度保持在23.5℃±0.1℃,数据选择测定数值不超过0.20‰。
2.5数据处理
采用SPSS24.0 软件对58个元素(已剔除低于检测限的元素),甘油碳,乙醇碳和水氧同位素数据进行ANOVA(Duncan's)、PCA及LDA。Origin2018软件作图。
3.结果与分析
3.1多元素分析
目前ICP-MS灵敏度高、检测限低,可以多种元素同时分析。对数据进行化学计量学方法分析,以检验各产地之间的差异,更准确反应葡萄酒的地理起源信息。采用方差分析和事后多重比较(Duncan's),从58种元素含量数据中识别出可以鉴别产地的关键因素。方差结果显示,显著水平p<0.05(下同)时,34个元素有显著性差异,其中Li、Ti、Cu、Sr、Mo、Rh、Ag、Mg、In、Eu、Lu、Ir、Th、Cs、Ru、Ta、Re、Os、Pt及水氧,共20元素在五个产区间有极显著性差异(P<0.01,下同)。其中HL、XJ和HX可以用Ir、Os、Pt、Li、Mg、Ge、In相互区分(winesamples from HL , XJ and HX can be mutually discriminated by Ir、Os、Pt、Li、Mg、Ge、In);Li、Ti、Cu、As、Sr、Rh、Mg、Ru、Ta、Re可以将YCZ、YH分为一组,并与HL、XJ区分开;Gd、Dy、Er、甘油碳元素可以将YCZ地区与其他四个产区分开;Li、Mo、Rh、Ag、Mg、Tm、Yb、Lu、Ir、Th、Ta、Re、Os、Pt元素将HL和XJ区分开。没有任何一种矿质元素可以将五个产地同时分开,只有利用多元素分析方法才能有效鉴别产地。

如表二所示,可以看出大量元素Cu在XJ含量最高,约为YH两倍,与文献介绍新疆各地土壤中含铜量较高的结果一致YH产区Cu含量较低,可能是因为降雨量少,葡萄不易染病,较少使用含铜多的波尔多液,使Cu在土壤中积累少。其余大量元素没有显现出葡萄酒更多的产地信息,可能由于土壤中大量元素本身含量较高,在葡萄种植过程中化肥的使用又对其含量造成影响,使大量元素在不同产地间差异不大。Li元素在HL含量最高,约为YCZ的4.7倍,可能是由于贺兰山地区有Li含量较高的多灰岩,植物吸收一些岩溶水中的Li元素,导致该地区葡萄酒中Li元素含量高。田海燕研究宁夏贺兰山地区土壤、葡萄及葡萄酒中矿质元素含量,结果表明Li可以作为HL鉴别的特征性元素。而云川藏地区的Cs、Rb元素含量最高,分别约为HX的5.5倍,HL的1.5倍,可能因为云川藏取样地区多锂云母,其中储存有较多Cs、Rb。N.S.ANGUS等人利用稀土元素对新西兰葡萄酒分类,研究发现在膨润土澄清时会增加稀土元素含量,而又因其本身元素含量低,最终认为稀土元素在产地鉴别上应用价值不大。本实验测定15种稀土元素中,仅有一种元素Eu在5个产地有极显著差异,其余稀土元素中均无差异。为更直观显示5个产地葡萄酒元素差异,对有极显著差异的元素作箱线图(如图2,其余元素箱线图见补充材料)。

Notes:箱线图中方框包括50%的数据,底部和顶部分别表示第一(Q1)和第三(Q3)四分位数,红线显示中位数(Q2),四分位距为Q3-Q1,Q3、Q1分别向上下延申1.5倍,期间距离称为内限,Q3、Q1分别向上下延申3倍,期间距离称为外限,在内限和外限之间用圆圈标记的点为温和异常值,在外限以外用*标记的为极端异常值。

图2 用于区分产地20种元素箱线图

Figure 2 is used to plot the boxes of 20 elements from differentorigins.


表2中国不同产地元素含量


Table 2 Element Contents inDifferent Origins of China


                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         

 

Variable

 

HL (35)

 

XJ (35)

 

YCZ (36)

 

YH (16)

 

HX (20)

 

Be

 

0.087 ± 0.072a

 

0.105 ± 0.170ab

 

0.203 ± 0.257b

 

0.088 ± 0.050a

 

0.134 ± 0.126ab

 

Ti

 

458.164 ± 130.014b

 

474.960 ±142.345b

 

325.111 ±  123.643a

 

329.144 ± 91.990a

 

372.790 ± 88.798a

 

Mn

 

1706.312 ± 402.359a

 

1991.175 ± 463.638abc

 

2286.978 ± 668.689c

 

2045.800 ± 790.341bc

 

1945.376 ±348.725ab

 

Cu

 

167.790 ± 74.166b

 

173.466 ±105.452b

 

119.169 ± 66.238a

 

91.288 ± 42.663a

 

108.963 ± 44.520a

 

As

 

5.621 ± 2.257b

 

5.449 ±1.644b

 

4.225 ± 2.235a

 

4.006 ± 1.364a

 

4.944 ± 1.479ab

 

Rb

 

1005.014 ± 456.571a

 

1321.797 ±706.322ab

 

1499.169 ± 787.477b

 

1180.344 ±327.682b

 

1000.784 ± 635.578a

 

Sr

 

2242.433 ± 561.396b

 

2054.179 ± 747.223b

 

1319.228 ± 580.026a

 

2078.329 ± 431.028a

 

2147.203 ± 351.916b

 

Mo

 

1.672 ± 0.987b

 

2.869 ±1.268c

 

1.289 ± 0.420ab

 

1.113 ± 0.405a

 

1.562 ± 0.989ab

 

Rh

 

0.083 ± 0.019c

 

0.065 ± 0.021b

 

0.039 ± 0.049a

 

0.025 ± 0.045a

 

0.064 ± 0.009b

 

Ag

 

0.086 ± 0.020cd

 

0.074 ± 0.020bc

 

0.094 ± 0.033d

 

0.055 ± 0.015a

 

0.061 ± 0.029ab

 

Pb

 

12.637 ± 6.424ab

 

9.204 ± 5.071a

 

13.872 ± 8.556b

 

12.831 ± 4.635ab

 

9.477 ± 3.601a

 

Bi

 

0.152 ± 0.069ab

 

0.109 ± 0.070a

 

0.208 ± 0.166b

 

0.125 ± 0.077a

 

0.115 ± 0.104a

 

Mg

 

150839.999 ± 25351.168b

 

169949.232 ± 36031.726c

 

116394.742 ± 33711.528a

 

126799.144 ± 18235.147a

 

151280.908 ± 17178.593b

 

Ge

 

0.029 ± 0.030ab

 

0.048 ± 0.012c

 

0.022 ± 0.042a

 

0.031 ± 0.048abc

 

0.045 ± 0.013bc

 

In

 

0.004 ± 0.005bc

 

0.003 ± 0.003b

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000 ± 0.000a

 

0.006 ± 0.007c

 

Eu

 

0.020 ± 0.025bc

 

0.030 ± 0.012c

 

0.014 ± 0.035b

 

0.000 ± 0.000a

 

0.031 ± 0.008c

 

Tm

 

0.000 ± 0.002a

 

0.003 ± 0.002b

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000 ± 0.000a

 

0.004 ± 0.002b

 

Lu

 

0.001 ± 0.002a

 

0.006 ± 0.003b

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000 ± 0.000a

 

0.006 ± 0.003b

 

Ir

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000± 0.001b

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000 ± 0.000a

 

0.001 ± 0.000c

 

Th

 

0.000 ± 0.000a

 

0.001 ± 0.001b

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000± 0.000a

 

0.001 ± 0.001b

 

Cs

 

1.987 ± 0.860a

 

1.763 ±1.251a

 

5.131 ± 3.632b

 

4.425± 1.802b

 

0.929 ± 0.371a

 

Ru

 

0.140 ± 0.060b

 

0.157 ± 0.056b

 

0.078 ± 0.054a

 

0.100 ± 0.000a

 

0.169 ± 0.034b

 

Nb

 

0.019 ± 0.033abc

 

0.080 ± 0.204ab

 

0.153 ± 0.259c

 

0.025 ± 0.045a

 

0.041 ± 0.024bc

 

Zr

 

1.540 ± 1.699a

 

1.113 ± 0.793a

 

2.614 ± 2.257b

 

1.225 ± 0.659a

 

1.862 ± 1.555ab

 

Hf

 

0.021 ± 0.041abc 

 

0.017 ± 0.014ab

 

0.044 ± 0.073c

 

0.000 ± 0.000a

 

0.033 ± 0.025bc

 

Ta

 

0.002 ± 0.004b

 

0.006 ± 0.003c

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000 ± 0.000a

 

0.007 ± 0.003c

 

Re

 

0.011 ± 0.011b

 

0.033 ± 0.014c

 

0.000 ± 0.000a

 

0.026 ± 0.011a

 

0.028 ± 0.007c

 

Os

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000 ± 0.000b

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000 ± 0.000a

 

0.001 ± 0.001c

 

Pt

 

0.000 ± 0.000a

 

0.001 ± 0.001b

 

0.000 ± 0.000a

 

0.000 ± 0.000a

 

0.001 ± 0.001c

 

Se

 

9.552 ±1.003c

 

9.562 ± 1.922c

 

8.614 ± 0.986ab

 

8.113 ± 1.251a

 

9.035 ± 1.728bc

 

Li

 

133.782 ± 41.877c

 

89.862 ± 52.170b

 

28.878 ± 34.817a

 

42.206± 19.441a

 

129.853 ±32.06c

 

Cd

 

0.335 ± 0.217a

 

0.355 ± 0.387a

 

0.881 ± 0.955b

 

0.288 ± 0.196a

 

0.322 ± 0.251a

 

δ13Cg

 

-31.617 ±1.126a

 

-31.321 ±1.792a

 

-28.836 ±3.267b

 

-31.830 ±1.404a

 

-31.470 ±1.022a

 

δ18O

 

0.019 ±3.703b

 

2.541± 2.594c

 

-7.308± 2.840a

 

-2.686 ± 1.973d

 

4.241±2.187e


注:表中各元素浓度单位均为ppb,数据均为平均值±标准差。不同的小写字母表示不同区域之间的显著差异。




3.2同位素分析


由于中国版图跨纬度范围广,不同气候和土壤类型都会对葡萄酒产地信息产生影响,δ18O受多重因素影响,如:降水、温度、纬度、海拔、季节、灌溉,使不同地区δ18O不同,测定δ18O标准化后在-16到10之间。葡萄酒水δ18O值与降水和灌溉水有里良好相关性,一般降水受纬度效应和高程效应影响较大,即一般情况下纬度越高,海拔越高,降水中δ18O会越低。一般情况冰山融水δ18O偏负,深层地下水源δ18O偏正。如图2箱线图所示,明显看出δ18O在产地间有明显不同。由表2可知五个产地δ18O平均数,即河西走廊>新疆>贺兰山>延怀河谷>云川藏。但由于影响因素较多,δ18O平均数不能准确说明产地差异。具体产地差异具体分析:HL主要来自于银川北部,处于中纬度地区,该地区夏季降水δ18O和浅层地表水δ18O数据显示均偏负,葡萄酒水中δ18O和采收期降水和灌溉水有直接关系,该地区δ18O显示出稍偏负的特性。XJ所有样品取样位置所处纬度相差不多,其δ18O差异大多来自海拔、降水及灌溉水。昌吉地区平均海拔400多米,灌溉用水来自天山山脉冰山融水,不如焉耆地区偏正程度大;焉耆地区(包括和硕县、博湖县、焉耆县)由于海拔较低,干旱少雨,年蒸发量大于降雨量,而表面水16O蒸发和扩散速度比18O快,使葡萄吸收地表水中δ18O含量较高,导致该地区数值偏正更多;同样,哈密市降水少,蒸发量大,为降水的100倍,导致δ18O偏正;而伊犁地处天山腹地,降水充沛,使δ18O比所测新疆其他地区都偏负。YCZ是葡萄酒水δ18O最偏负的地区,主要受海拔影响,青藏高原是我国最高海拔葡萄种植园,四川以高山葡萄园闻名,云南地区同样海拔较高,海拔和δ18O通常呈负相关。HX明显偏正更多,原因可能是中国西北部地区,水源主要是江、河支流,多地属于干旱或半干旱地区,降水来自于有较高δ18O的表面水蒸发形成,导致葡萄酒水中δ18O在该地区较大。YH年平均降水也较少,灌溉水为浅层地下水,使数值偏负。实验取样地理位置广泛,年份跨度大,品种多样,导致影响δ18O数值因素较多,方差分析结果仍显示出δ18O有极显著差异,表明δ18O是区分产地的良好工具。


在测定样品中包括1997年到2014年间5个不同产地142个样品,乙醇δ13C标准化后在-16到-30之间,甘油碳在-22到-35之间,如图3箱线图所示,可以更直观看出乙醇δ13C产地差异较甘油δ13C更小,δ13C主要与光合作用相关,而光合作用主要受年份和葡萄品种代谢的稳定影响,对于区分掺假葡萄酒和不同品种葡萄酒有较好作用,若单独使用甘油δ13C、乙醇δ13C无法鉴别葡萄酒产地,与H、O同位素结合分类效果更好


3.3主成分分析
葡萄酒中元素种类和浓度受多种因素影响,Dasa Kruzlicova等多位研究者认为葡萄品种在元素组成上有明显差异,P.P. Coetzee等人认为红葡萄酒和白葡萄酒在元素种类和含量上存在明显不同,Irina Geana等人得到葡萄酒元素组成和与其来源土壤之间具有相关性。若更加关注取样范围、葡萄品种、葡萄酒类型、土壤类型等因素,减少样品数量的局限,可以得到更好的分类效果。
主成分分析可以是一种有效减少变量的方法,将多个变集中于一个主成分,一般利用几个主成分即可代表大部分数据,在葡萄酒产地鉴别中,产地间矿质元素浓度和氧同位素比值存在差异,为进一步减少分析变量,拟采用主成分分析方法,分析ANOVA中有极显著显著性差异的20种元素含量,分析前对数据标准化处理(Z-score)。结果表明主成分分析具有筛选可以作为产地特征元素的作用,总共提取8个主成分,累计方差贡献率达到80.06%,说明8个主成分基本可以概括主要信息,其中主成分1方差贡献率为36.80%,主要包括葡萄酒水氧、Re、Ru、Mg、Lu及Sr等元素信息,主成分2方差累计贡献率达到14.61%,主要包括Rh、Cu、Sr等元素信息,主成分3方差累计贡献率达6.66%,与Ag元素相关程度较大。根据方差累计贡献率前三的主成分标准化后做3-D主成分分析得分图(图4),根据图4可以明显看出新疆、河西走廊可以和贺兰山、云川藏及延怀河谷明显区分开,YH和HL、YCZ均有重叠部分,XJ和HX也有重叠部分,总体看来相同产区数据比较集中,三维图仅展示出一个角度。图5利用PC1和PC2作图,XJ、HX具有正PC1的特性,YCZ、YH具有负PC1的特性,HL具有负PC2的特性,说明可以通过PC1和PC2的正负情况将产地YCZ、YH分为一组,XJ、HX分为一组,HL分为一组。图6展示了多元素变量信息在PC1和PC2的分布情况,PC1、PC2值较大的元素有:Th、Eu、Pt、Ir、Os、Ta、Lu、In、Re、δ18O;PC2偏正,PC1偏负的元素有:Mo、Ru、Mg、Li、Sr、Ti、Rh、Cu;有两个元素较特殊,Cs处于PC1偏正,PC2偏负的位置,可以用于区分HL、HX及XJ产区,Ag处于PC1和PC2都偏负的位置,同样可以用来区分XJ和HX。同时我们也对数据进行了聚类分析,聚类效果一般,详细树状图见补充材料。

3.4逐步判别分析

为更有效鉴别葡萄酒产区,明确各因素在区分葡萄酒产地产生的影响,采用Wilks Lambda test (p<0.01)and an F-statistic factor对五个产地34种元素142个样品进行逐步判别分析,数据样本分为100个样本的训练集和42个样本的测试集,样本集和测试集均包括五个产地。逐步判别结果显示建立了四个典型判别函数,典型判别函数1和Re、水氧、Pt、Lu、Ta、Tm、Rb、甘油δ13C、As及Mn最大绝对相关,典型判别函数2和Li、Rh、Th、Pb及Eu最大绝对相关,典型判别函数3与Mo、Ir、Mg、Ti、Ru、Se、Cu、Nb、Cd、Ge、Cs及Os最大绝对相关,典型判别函数4与Ag、Bi、In、Be、Zr及Hf元素最大绝对相关,四个函数有显著性差异,所以四个典型判别函数均有意义。分析结果将Li、Mo、Ag、Mg、Ir、Th、Ta、Re、Pt及葡萄酒水δ18O引入判别模型(表3),分类时选出对原始数据组的分类正确率达到90.8%,对YH产地的判别正确率均达到100%,HL样品有一个被误认为是YCZ,一个被误认为是YH;XJ有一个被误认为是HL,有三个被误认为是HX;YCZ样品有一个被误分为HL,四个被误分为YH;HX有两个被误分为XJ,142个样品中有13个样品被错误分类。又进行交叉检验来验证模型有效性,其正确率达到87.3%。判别分析结果提取二个特征值,累计得分即可达到90.2%,将数据标准化后带入标准化典则判别函数中,成功将HL、XJ、YCZ和YH、HX分开(图6),可以看出同一产区数据集中在同一区域,不同产区有其特定的区域,但仍有个别YH会和HL、YCZ混淆,HX会和XJ混淆,可能是因为本次使用样数量有限,取样产区地理位置跨度大,对红葡萄酒和白葡萄酒及葡萄品种不做区分,这些原因使相同产区间存在重叠现象,因此需要引入更多数据,建立更精细的判别函数。


表3 HL、XJ、YCZ、YH、HX交叉检验判分类结果


Table3 Classification results of HL, XJ, YCZ, YH and HX cross-tests


                                                                                                                                                                                                               

   

Original region

 

Predicted Group

 

Total

 

HL

 

XJ

 

YCZ

 

YH

 

HX

 

Count

 

HL

 

32

 

0

 

2

 

1

 

0

 

35

 

XJ

 

1

 

29

 

0

 

0

 

5

 

35

 

YCZ

 

2

 

0

 

30

 

4

 

0

 

36

 

YH

 

0

 

0

 

0

 

16

 

0

 

16

 

HX

 

0

 

3

 

0

 

0

 

17

 

20

 

%

 

HL

 

91.4

 

0

 

5.7

 

2.9

 

0

 

100

 

XJ

 

2.9

 

82.9

 

0

 

0

 

14.3

 

100

 

YCZ

 

5.6

 

0

 

83.3

 

11.1

 

0

 

100

 

YH

 

0

 

0

 

0

 

100

 

0

 

100

 

HX

 

0

 

15

 

0

 

0

 

85

 

100

 

Discriminant  model

 

YHL=0.502Li+0.284Mo+0.178Ag-0.768Mg-0.866Ir-0.675Th+0.652Ta-1.475Re-1.647Pt+0.499δ18O-3.637

 

YXJ=-0.766Li+0.303Mo+0.015Ag+1.278Mg+0.526Ir+1.959Th+0.866Ta+3.615Re+1.367Pt+2.634δ18O-9.008

 

YYCZ=-2.687Li+0.478Mo+1.162Ag-0.104Mg-0.985Tr-2.337Th-1.803Ta-1.965Re-0.91Pt-4.944δ18O-34.950

 

YYH=-1.415Li+0.077Mo-1.404Ag-0.488Mg-0.698Ir-1.104Th-1.896Ta-2.561Re-1.214Pt-1.294δ18O-5.737

 

YHX=2.931Li-1.948Mo-1.307Ag-0.314Mg+2.927Ir+2.843Th+2.105Ta+1.842Re+3.099Pt+4.452δ18O-13.047


*将样本中的相应值替换为上述判别式,并且将具有最大数据的一个值视为被划分为样本所属的类别。


         

 

 

注:黄色为HL,红点为XJ,蓝色为YCZ,紫色为YH,绿色为HX。

 

图6标准化典型判别函数图

 

Figure 6 Standardized Canonical  Discriminant Function Diagram


近五年来中国对葡萄酒产区鉴别研究发展不多,Jiangfeng Cheng等人对中国宁夏、河北的葡萄酒分类时,找到Mn、Sr两个特征性判别元素并得到良好分类率,但其测定三个产地仅使用48个样品,可能随着样品的增加会导致分类率下降,使方法的应用性降低。Shuangxi Fan等人对中国新疆(昌吉)、云南(弥勒)及河北(昌黎)的188个葡萄酒进行分类,使用PLS-DA和SVM算法,分类正确率达到95%以上,但因其选择几个地区距离较远,地区差异得已显现,且取样地点具体到州、县,取样相对集中,若将该方法应用于全国产区,仍需探索方法。后续中国葡萄酒产区的研究中,我们应收集更多不用年份、更多品种和更小产区样品,尝试更多化学计量学分析方法,尽可能减少年份、品种、酿造工艺等因素对判别产地的影响,建立普遍适用于中国葡萄酒产区的模型。中国葡萄酒产地地域广阔,建立葡萄酒产地属性数据库面临许多挑战,但我们已初步建立判别HL、XJ、YCZ、YH、HX产地函数,可有效区分HL、XJ、YCZ和YH、HX产区,为今后开展中国葡萄酒产区鉴别工作奠定基础。
4结论
本实验采用58个元素、甘油δ13C、乙醇δ13C及葡萄酒水δ18O对5个葡萄酒产区的142个葡萄酒样品进行分类,经ANOVA筛选出20个有显著差异的元素,再对这些元素进行PCA、CA分析,可能由于本实验取样地域范围广,检测数量有一定局限性,导致PCA和CA结果一般。为进一步得到良好分类,选择逐步判别分析,对有显著性差异的32种元素再次筛选。结果表明,对原始数据分类达到90.8%,交叉检验正确率达到87.3%。甘油δ13C、乙醇δ13C对区分产地效果不大,不能单独用于葡萄酒产地鉴别;葡萄酒水δ18O具有产地间差异,但受降水、海拔、纬度等因素影响较大,将其与矿质元素或其他同位素结合会产生更好的效果。
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2019/10/8 8:33:40 Last edit by hhciq 举报
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