主题:【第十二届原创】浅谈LC-MS/MS药动学方法学考察中的全血稳定性实验

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浅谈LC-MS/MS药动学方法学考察中的全血稳定性实验

利用液质技术测定药动学时,方法学考察是至关重要的一步,除了比较经典的精密度试验、样品稳定性试验、溶液稳定性实验、专属性试验、基质效应考察、回收率实验和长冻样品稳定性试验等,大多实验者容易忽略的是全血稳定性实验。全血稳定性实验,顾名思义是指全血从动物体内取出,放置一段时间是否会影响药物的浓度。而大多数药物由于自身性质的原因会导致分解,进而影响测定特定时间点下的药物血浆浓度。因此,对于不稳定的药物,我们不仅需要在全血离心得到血浆后考虑药物的稳定性,还需要考察药物在全血中的稳定性。
药物在全血中被转化掉了,也就是biotransformation。全血或血浆中的转化一般会发生在具有易水解位点的化合物,如具有酯键或酰胺键的化合物等。原因很简单,全血或血浆中含有水解酶。要搞清楚你的化合物是不是被水解掉了,也很简单。如果你的血是EDTA抗凝的,那么水解反应这个原因就不可能了,因为水解酶要发挥作用是需要金属离子(镁离子)的,而EDTA可以螯合掉金属离子(镁离子)。因此你只需要比较一下肝素钠和EDTA两种抗凝剂的孵育结果就行了。如果肝素钠不下降,EDTA下降就是这个原因了。如果都下降,就不是这个原因了。当然,如果真的是水解反应所造成的话,一般都应该能同时观察到全血和血浆的浓度下降。
我们举一个例子为大家演示全血稳定性实验的操作步骤。首先购买无菌抗凝大鼠全血,要求大鼠来源健康,全血由EDTA抗凝。见下图。全血中的红细胞易破裂,应严禁将全血冻存,且远离冰箱壁等低温源。保存期间适时摇晃全血瓶,使红细胞均匀吸收养分和氧气,防止变黑。储存条件:2-6℃保存,无菌取用。


我们的分析物结构不稳定,在水中和甲醇中易水解,主要水解产物我们也购买了标准品,打算利用液质技术同时检测分析物和水解产物的浓度。而分析物由于结构的原因,对pH要求较大,即应在pKa范围内才能稳定存在。因此我们的实验目的也清晰了很多,建立方法改善药物不稳定因素,尽量做到测定药物浓度为真实浓度。那么我们的方法就是在取血前,在抗凝管内加少量酸溶液,改善pH,进而使药物稳定存在。此处实验我们尝试了不同浓度和体积的甲酸、乙酸 ,以及不同稀释液:水、生理盐水、PBS等。最终选择的是10%乙酸的PBS溶液,1 mL全血对应50 mL即可保证分析物稳定不水解。
实验开始,我们设计了低、高浓度的分析物在空白血浆、加酸调pH后的血浆条件下,分别在0,1,2,4小时37℃水浴保存后,用4000rpm离心机离心操作将血浆取出,然后将血浆沉淀蛋白,取上清进样分析。见下图。此处需要注意的是全血不能用涡旋仪涡旋,否则红细胞会破裂,我们选用的是摇床,将加了分析物的全血摇匀。见下图。
最终实验结果也是符合我们的预期,文章结尾依然要感谢仪器信息网为我们提供原创大赛平台,互相学习,互相进步!Fighting!


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