主题:【第十二届原创】水产品中孔雀石绿荧光检测法优化

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avih1981
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鹤壁农检联合队发表于:2019/10/24 14:42:27 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复
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水产品中孔雀石绿荧光检测法优化

        摘要:水产品中孔雀石绿应用广泛、危害性大。GB/T20361-2006荧光检测法检测成本低,但是前处理复杂、繁琐、耗时,且回收率不稳定。本文通过优化提取方式、浓缩条件、检测条件等,建立高效液相色谱荧光法检测水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的方法。优化后的方法样品前处理时间、样品出峰时间比GB/T20361-2006大大缩短,且分析结果回收率高、重复性好。
关键词:水产品  孔雀石绿  检测
        一、孔雀石绿的危害性
        孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体,既是杀真菌剂,又是染料。具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用,已被列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。我国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》和我国《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第四批)通知》明确规定所有食品禁止使用孔雀石绿。但是由于孔雀石绿价格低廉,效果显著,在水产养殖中广泛应用。养殖户用它来预防鱼类的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等;不法商贩用它提高运输过程中鱼的存活率。并且使用孔雀石绿后的鱼死亡后,鱼鳞闪闪发光,颜色较为鲜亮,仿佛刚死一般,这又大大增加了死鱼出售的概率。
        二、检测材料与方法
        (一)主要仪器设备与试剂
        1、主要仪器设备
        电子分析天平(感量0.0001)、电子分析天平(感量0.01)、高速冷冻离心机、PH计、氮吹仪、超声波清洗机、涡旋混合器、固相萃取装置、安捷伦1260高效液相色谱仪配荧光检测器。
        2、试剂
        乙腈(色谱纯)、二氯甲烷(色谱纯)、无水乙酸铵(分析纯)、冰乙酸(优级纯)、氨水(分析纯)、硼氢化钾(分析纯)、盐酸羟铵(分析纯)、对-甲苯磺酸(分析纯)、酸性氧化铝(分析纯)。
        3、标准品
        孔雀石绿标准溶液(100Uug/mL)
        4、其他耗材
        酸性氧化铝固相萃取柱(500mg、3 mL)、Varian PRS柱(500mg、3mL)、0.45um有机滤膜、一次性注射器。
        (二)液相色谱条件
        色谱柱:安捷伦C18柱4.6mm×100mm,粒度3.5um;流动相:乙腈+乙酸铵缓冲溶液(0.125mol/L,PH4.5);流速1.3mL/min;柱温:35℃;激发波长:265nm,发射波长:360nm;进样量:5uL。
        (三)样品前处理
        参照GB/T20361-2006中的样品前处理进行取样、提取、净化,但将样品前处理的匀浆提取改为样品涡动和离心;用离心的方法代替分液漏斗分液;旋转蒸发温度调整为35℃。
        具体优化方法如下:
        1、样品提取优化:本方法将GB/T20361-2006方法中的10000r/ min匀浆提取30s改为加标后样品手摇振荡2 min,加入酸性氧化铝后手摇振荡2 min ,再4000r/ min离心10min,再静置10 min。手摇振荡既减少了匀浆过程中加标损失,影响回收率;又增加孔雀石绿的溶出效果。静置确保了分离效果,使它提取完全,提高实验回收效果。
        2、样品浓缩温度优化:GB/T20361-2006方法中要求45℃旋转蒸发至近干,改为35℃旋转蒸发近干。实验过程中发现45℃旋转蒸发时孔雀石绿会被带出、25℃旋转蒸发速度太慢,都会影响回收率。对比显示35℃旋转蒸发回收率最为满意。
        (四)校准曲线与加标回收情况
        1、校准曲线
以孔雀石绿中间溶液配成标准的工作曲线浓度分别为1.00 ng/mL、2.00ng/mL、5.00 ng/mL、7.00 ng/mL、10.00 ng/mL。以峰面积为纵坐标,以浓度为横坐标做校准曲线,做一校准曲线,相关系数为0.9999。孔雀石绿在1-10ng/mL范围内线性良好。
        2、加标回收
        取10份样品加入浓度为20ng/mL的孔雀石绿标准溶液200uL,做九个重复,做一个空白。按上述方法进行前处理和检测,测得回收率范围在85%-105%。
        三、注意事项
        1、称样、加标、振荡后要静置5分钟,确保溶出效果。
        2、离心后的上清液转移至125mL分液漏斗中时要注意,不可吸入油脂、酸性氧化铝。
        3、弃去酸性氧化铝柱后以及定容前要用剪平头的吸耳球吹PRS柱近干,保证平行和回收率。
        4、旋转蒸发时,转速要由慢到快,保持转速200左右,水滴成滴滴下,不可成线,过快时要关掉真空泵。旋转蒸发近干要严格控制好,蒸发太快、蒸发温度太高都会导致回收率降低。
        5、尽量减少溶液转移次数,转移次数影响回收率。
        6、样品过柱和洗脱时,流速不能太快,否则样品或洗脱液不能与柱子充分接触,导致回收率降低。
        四、结论
        综上所述本文探索改进的水产品中孔雀石绿检测方法,样品前处理时间、样品出峰时间比GB/T20361-2006缩短,节省了人力物力,且孔雀石绿在1-500ng/mL范围内线性良好,相关系数为0.9999,回收率范围85%-105%。
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zyl3367898
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数据齐全,检测过程完整,加些图谱或图片会更好。