主题:【第十三届原创】屠宰场非洲猪瘟检测结果不理想原因分析

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解密双螺旋团队发表于:2020/06/01 08:39:18 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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屠宰场非洲猪瘟检测结果不理想原因分析



某生猪定点屠宰场非洲猪瘟自检结果多次不合格,为探究原因,近期对其所用试剂、设备及人员操作等方面进行检查,结果如下:

1.扩增部分

2020425,对某生猪定点屠宰场所用扩增试剂进行验证。样品采用经本站检测有明确结果的核酸,扩增设备采用该场所用PCR仪,扩增试剂采有该场使用的扩增试剂,结果如下:

设定值

检测结果

差值

备注

P1已知核酸

24.90

19.89

-5.01

P2已知核酸

28.17

23.94

-4.23

P3已知核酸

31.64

26.69

-4.95



考虑到该屠宰场PCR仪扩增程序中设置了5个循环的预扩增,扩增结果会比正常扩增程序Ct值减少5个。加上这5个循环后,检测结果与设定值吻合程度很高,说明所用扩增试剂、PCR仪及移液器、人员操作均无大的问题。

结合该场多次未能对盲样得出检测结果,初步分析问题出在核酸提取阶段,可能的原因有:一是提取试剂存在质量问题,二是检测人员取样不当,三是所用离心机转速偏低,四是检测人员操作不当。

2.核酸提取部分

2020427,对某屠宰场所用核酸提取试剂进行验证。样品采用经我站检测有明确结果的模拟阳性样品,提取试剂采用该场使用的提取试剂,扩增试剂采用本站使用的扩增试剂(某屠宰场试剂扩增程序无法在本站PCR仪运行),扩增设备采用本站PCR仪,离心机分别采用6000/分和12000/分,结果如下:

设定值

检测结果

差值

备注

P2模拟样品

28.17

32.88

+4.71

6000/

P2模拟样品

28.17

32.96

+4.79

12000/

P3模拟样品

31.64

35.87

+4.23

6000/

P3模拟样品

31.64

35.83

+4.19

12000/



考虑到某屠宰场所用的提取试剂为粗提方式,最终核酸体积为样品的6倍,而本站所用的提取试剂为柱提方式,最终核酸体积为样品的1/4,两者体积相差24倍,折算成Ct值为4.6。扣除这些影响因素后,所得结果与设定值吻合程度很高,说明提取试剂本身无大的问题。另外,考察离心机不同速度,两者得出的结果吻合程度也非常高,说明离心机两种转速对核酸提取的影响程度很小。

3.结果不理想原因分析

3.1核酸提取试剂反复冻融导致提取效率下降

425某屠宰场第一次对模拟阳性样品(Ct24.90)进行提取和扩增,所采用的核酸提取试剂已反复冻融4次,P1模拟阳性样品Ct33.28。与标准操作相比,样品加入量仅为1/4引起Ct值增加2,粗提引起Ct值增加4.65+40次循环引起Ct值减少5,影响因素叠加引起Ct值增加1.6,扣除影响因素Ct值相差6.78,同时P2P3样品则均未检出。

而直接用核酸进行扩增,结果吻合程度很高,说明核酸提取试剂反复冻融可能导致提取效率快速下降。

3.2冷冻保存试剂未充分回温

425某屠宰场第二次对模拟阳性样品(用阴性血浆配制)进行核酸提取时,加入量为40μL,但提取试剂未充分回温,大部分尚未融化即开始提取,结果所有模拟阳性样品均未检出。说明试剂充分回温,对于提取效果非常重要。

3.3样品加入量不当

某屠宰场所用核酸提取试剂的说明书明确规定,抗凝血加入量10μL,血浆加入量40μL。但425某屠宰场对模拟阳性样品(用阴性血浆配制)进行第一次核酸提取时,提取试剂经回温,但样品加入量仅为10μL,这种操作会导致最终结果Ct值增加2

4操作建议

4.1提取试剂避免反复冻融

在第一次启用提取试剂时,取洁净离心管将提取试剂分装成小份后冷冻保存,具体每份的体积视检测量而定,以1~2次用完为宜。每次只取1份或2份,未用完的冷藏保存,并于第2天用完。

4.2试剂应充分回温

不论提取试剂还是扩增试剂,均应充分回温后方可进行操作。在室温较低且未配备水浴锅的情况下,可用杯子盛上温水(以不超过40为宜),将试剂投入后进行回温,待试剂完全融化且温度达到20~30左右方可取出使用。

4.3严格按照说明书加入样品

提取试剂盒说明书明确抗凝血取10μL、血浆或血清取40μL,对于说明书未明确说明加入量的,如比对时的病毒悬液,应及时向兽医实验室技术人员或试剂盒生产厂家技术人员咨询。

4.4冷冻试剂融化或混匀操作后进行瞬时离心

冷冻试剂融化或混匀操作容易将液体溅到离心管壁和管盖,应瞬时离心时再开盖进行下一步操作,以免造成污染和液体损失。

4.5操作时应避免引起交叉污染

在开启离心管盖时,应该用右手拇指和食指扣住离心管盖外沿,缓慢、小心开启离心管盖,避免用左手拇指肚顶住离心管盖向上弹开,此类操作因离心管内压力骤降极易引起管内液体溅出,且拇指肚极易接触离心管盖内壁造成交叉污染。

4.6提取环节增加阴阳对照

目前多数快速检测试剂盒,仅要求在扩增环节添加阴阳对照。此种情况下,如果提取试剂出现问题,或提取环节操作不当,检测人员很难发现问题。建议屠宰场自检实验室在提取环节增加阴阳对照,对提取环节进行质量控制:如阴性对照出现阳性结果,说明提取过程受到污染,如阳性对照Ct值偏高或无Ct值,说明提取试剂有问题,或操作不当未成功提取核酸。

4.7结果判定应严格遵守试剂盒说明书

试剂盒说明书明确规定:Ct值小于35判为阳性,介于35~38且有典型扩增曲线判为可疑应再次检测,若结果重复则判为阳性。但PCR仪却简单设置为Ct值小于35判为阳性,Ct值大于35判为阴性,导致Ct值介于35~38的样品错判结果。应及时联系设备厂家,请技术人员及时调整判定条件。

4.8建议核酸采用柱式提取

与柱式提取相比,目前屠宰场普遍采用的粗提法,存在核酸浓度低、杂质多等缺点,对于复杂样品如抗凝血检测效果不理想。建议有条件的自检实验室改用柱式提取,以切实提高检测质量。
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