主题:【第十三届原创】提高屠宰场非洲猪瘟自检质量应关注的几个问题

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解密双螺旋团队发表于:2020/06/01 08:42:07 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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提高屠宰场非洲猪瘟自检质量应关注的几个问题



1样品采集及保存

1.1样品种类

屠宰企业非洲猪瘟自检首选样品是抗凝血,但抗凝血提取核酸不太方便,且采样成本较高,有的企业改用血浆或血清检测。

对于是否可以采用血浆或血清检测,需要综合考虑以下因素:一是设备,血浆或血清需要采用离心机分离;二是检测过程,抗凝血含有红细胞、血小板及抗凝剂,对提取及扩增有一定影响;而血浆或血清较纯净,对后续处理影响程度较小;三是检测结果,据青岛立见数据,来源相同的情况下,与抗凝血相比,血浆的Ct值增加1左右,血清的Ct值增加2左右。各地可根据具体实际,分析确定采用何种样品。

1.2采样器材

首选采血针/注射器/头皮针+抗凝管,但抗凝管成本高,有的企业改用采血静置分离血浆或血清用于检测。

针对抗凝管价格偏高的问题,可改用“普通离心管+抗凝剂”替代。经查阅资料,一般认为1.5mgEDTA可以阻止1mL血液凝固。为方便采样,一般将EDTA配制成浓度为15g/L的生理盐水溶液,按1/10比例加入离心管,如1.5mL离心管加入0.15mL,可于40左右烘干,也可直接使用。血液注入该离心管后,应颠倒数次将全血与抗凝剂充分混匀。应该注意的是,EDTA浓度过高会影响后续的提取及检测结果。因此,一是要严格按照比例添加抗凝剂,二是加入血液量不足时,要向离心管中补足生理盐水或PBS液。

1.3混样比例

考虑到试剂盒灵敏度,以及企业成本接受能力,混样比例控制在1:10左右较好(粗提),如果采用柱式提取,可将混样比例提高到1:100

是否可以高比例混样,需从以下几个方面考虑:一是对Ct值的影响,相对于疫控机构常用的1:5混样来说,1:20混样Ct值约增加2.01:100混样约增加4.31:500混样约增加6.7。二是对提取效率的影响,在柱式提取中,混样比例过高会导致样品中病毒核酸含量极低,提取柱的吸附膜可能无法与病毒核酸有效结合,导致假阴性;三是对扩增结果的影响,理论上核酸稀释多倍后,只要扩增循环数足够多,仍能检测出阳性结果。但扩增体系中核酸浓度过低时,引物探针可能无法与核酸有效结合,导致假阴性。

1.4样品保存

对于屠宰企业自检后的样品,推荐冷冻保存半年以上。但目前多数企业仅保存一个月左右。根据农业农村部201911月文件,要求对屠宰企业201951日后的留样进行复检。从该文件上可以看出,部级层面是要求留样长期保存的。

1.5留样要足

政府机构实验室普遍采用柱提法提取核酸,取样量一般每次需200μL,因此留样量不宜少于1mL

2核酸提取

2.1提取方式

为了提高核酸提取效率和非洲猪瘟检出率,推荐采用柱式提取。但目前多数企业采用粗提(本人一直反对免提的说法,因为目前市面上的免提试剂盒,实际上还是有核酸提取的试剂和过程,只不过不进行洗脱而已,所以实际上是粗提而不是免提)。

屠宰企业是否可以粗提,需要考虑以下问题:一是粗提后的核酸,含有EDTA等影响后续扩增效果的成分,如果扩增时取样不仔细,还可能吸入红细胞等杂质,影响扩增结果的准确性;二是柱式提取一般取样200μL得核酸50μL,相当于浓缩4倍,而粗提一般取样10μL得核酸混合液210μL,相当于稀释21倍。在其他因素相同的情况下,粗提核酸比柱提结果Ct值约增加6.4。如果叠加上混样比例1:200导致的Ct值约增加5.3,影响值可以达到11.7,绝大多数阳性样品都会出现阴性结果!

结论:高混样比例和粗提,两者只能选其一,且推荐采用柱式提取。

1:5

1:20

1:100

1:500

柱提

首选

 

(以此为基准)

可接受可推荐

 

Ct+2.0

可接受

 

Ct+4.3

可接受不推荐

 

Ct+6.7

粗提

可接受不推荐

 

Ct+6.4

可接受不推荐

 

Ct+8.4

不可接受

 

Ct+10.7

不可接受

 

Ct+13.1



2.2提取器材

一是离心机:不管是柱提还是粗提,均需要使用离心机。因非洲猪瘟病毒是DNA病毒,对温度的影响不太敏感,因此屠宰场自检可不使用冷冻离心机。离心速率建议10000/分以上,条件有限的情况下也可使用6000/分,但时间要延长一倍。建议使用多合一转子,八联管与2mL离心管可以在同一个转子上离心,不必每次更换转子。

二是移液器:PCR扩增体系取液量很少,且精度要求高,建议使用进口移液器;柱提取样量较大,可使用国产移液器;粗提取样量较小,建议使用进口移液器。

三是移液器吸头:PCR由于扩增效率极高,很容易造成污染,导致假阳性结果。因此在取样、提取和扩增各环节,务必使用滤芯吸头。

2.3提取过程

一是注重防护。提取过程必须穿工作服,戴口罩、手套。在提取过程中,一旦发现或怀疑手套受到污染,应立即更换!

二是环境消毒。此处的消毒,更多的是指使核酸降解,而不是使病毒失去活力。在实验开始前,需用含0.3%有效氯的消毒液喷洒实验台面作用1分钟后用纸巾擦干,然后用75%酒精处理一遍,有条件的可再用DNA祛除剂处理一遍。对移液器等器材也可采用相同方法对外表面进行类似处理。

三是试剂回温。冷冻或冷藏的试剂,应提前取出在室温中静置一段时间,待试剂回到室温后再使用。

四是瞬时离心。所有试剂或样品,在回温后使用前,均需瞬时离心,将液体甩至管底,确保管盖或管壁。有特殊规定不能离心的除外!

五是取样准确。取样前核对移液器量程是否设置正确,插入液体前应将活塞揿到第一阻力位稍向下,吸入液体取出后应检查吸头内是否有气泡,移出液体后应检查吸头内是否还有少量液体。

六是更换吸头。除非向空的离心管内首次加入液体,或移液时不接触离心管及管内液体,否则每加一次液体均应更换吸头。

七是冷却加液。核酸提取过程一般均有加热反应步骤,此步结束后应待管内液体冷却至室温后,方可进行下一步操作。

八是加热洗脱。在柱式提取时,为了提高洗脱效率,建议将活脱液加热到65左右再进行洗脱。因试剂盒附带的洗脱液一般含有EDTA成分,对后续扩增有一定影响,因此建议改用高压灭菌水洗脱。

3核酸扩增及结果分析

核酸扩增过程中应注意问题与提取过程类似,不再赘述。另外应注意:

一是混匀分装。对于非预分装的多组分试剂,在使用前应将所有试剂按需要量加在同一离心管内,混合均匀后瞬时离心,然后均匀分装到八联管内。在加入待检核酸后,同样需要瞬时离心才能放入设备扩增。

二是盖紧管盖。八联管在放入设备扩增前,一定要仔细检查是否盖紧管盖。如未盖紧,一是扩增过程中高温易使试剂蒸发,二是扩增产物会随水汽逸出污染设备加热模块。

三是产物处理。扩增后的八联管,应及时从设备中取出,投入带有含0.3%有效氯的消毒液中,转移至远离实验室的区域反应半小时以上,再作相应处理。

四是结果分析。屠宰企业所用的扩增设备,普遍采用固定阈值来判定结果,相对来说结果分析比较容易。

需要注意的有两点:

一是对于可疑样品如何处理?有的试剂盒规定,Ct值介于35~40的需进行再次检测,如仍出现典型的扩增曲线应判定为阳性。遇到此种情况,一定要对核酸进行再次检测!不能直接判定为阴性!

二是出现一定数量的高Ct值阳性样品如何处理?在经常检测非洲猪瘟的实验室,有时会出现一定比例的高Ct值阳性样品(Ct35以下判定为阳性,出现20%以上Ct30~35的样品),这时不能轻易结果为阳性!很可能是设备、环境受到污染,或者是试剂出了问题!可以参照环境消毒的内容,对实验台面及移液器进行消毒,再次提取核酸进行扩增,出现相同结果可更换另一种试剂进行再测,如还是出现相同结果,可判定为阳性。为慎重起见,也可将样品送至县、市兽医实验室,采用柱提法提取核酸进行扩增,查找出现阳性的原因。

4结果报告

如果检测过程发现阳性样品,一定要按照规定程序及时上报!不得瞒报、迟报、漏报!
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dadgoh
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