主题:【第十三届原创】分子生物学实验操作要点及防污染策略

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解密双螺旋团队发表于:2020/06/01 08:46:00 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复
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分子生物学实验操作要点及防污染策略



0前言

分子生物学实验,对于动物疫病监测实验室来说是个新事物。由于其极高的扩增效率,操作稍有不慎即可造成污染。下面是动物分子生物学操作要点,以及防污染的一些策略,内容很具体也很啰嗦,但严格遵守的话可以大大提高操作成功率,并尽可能减少交叉污染,供参考。

1 总体原则

1.1 严格做好分区。一般应设置样品处理、核酸提取和核酸扩增三个区,对于普通PCR还应设置核酸检测区。

1.2 避免接触过高浓度样品(如阳性对照)内壁的手套、器具,再次接触其他样品(如待检样品)的内壁。

1.3 避免打开扩增产物的容器,因其含有高浓度目标片段。

2 设备防污染

2.1 消毒剂选择

平常所说的消毒剂,与分子生物学实验所说的消毒剂,概念上有一些差异。以非洲猪瘟为例:

平常所说的消毒剂,是指杀灭病毒的活性,使其不再具备感染能力。故常采用0.8%氢氧化钠溶液,作用时间30min

而分子生物学实验的消毒,其着重点是破坏病毒核酸,使其不对后续实验产生污染。常采用有效氯含量3g/L的氯制剂溶液,对于有效氯含量30%的消毒药,配制成1%的溶液即可。由于氯制剂对金属表面有较强的腐蚀性,所以消毒时间应控制在1~3min

2.2 生物安全柜

撤出柜内所有物品,向柜壁(除上部)喷洒含氯消毒剂,作用1min后用纸巾擦干,注意不同区域更换纸巾;有条件的可再喷洒核酸祛除剂,作用1min后用纸巾擦干。

2.3 离心机

卸下转子,用带含氯消毒剂的纸巾擦拭内壁,然后用带洁净水的纸巾擦拭内壁,最后用干的纸巾擦干。转子浸泡于含氯消毒剂中作用1min,然后用清水冲洗干净,晾干或低温烘干。

2.4 移液器及支架

用带含氯消毒剂的纸巾擦拭,尤其是移液器头部容易接触离心管壁处。然后用带洁净水的纸巾擦拭,最后用纸巾擦干。

3 器具防污染

3.1 不锈钢剪刀、镊子

做好一个样品一把,使用后浸泡于含氯消毒剂中,实验完毕后清洗,然后高温烘干。

不同分区的剪刀、镊子专用。用于夹取洁净物品的镊子,也应经常消毒、清洗并高温烘干。

3.2 离心管

一次性使用,以无DNA/RNA酶的洁净离心管为佳。

不同分区的离心管应专用。

3.3 移液器吸头

一次性使用,以带滤芯的无DNA/RNA酶的洁净吸头为佳。

不同分区的吸头及吸头盒应专用。

4 防护用品

4.1工作服

不同分区的专用,经常消毒、清洗并晾干。

条件允许的情况下,不同分区的工作服,应采用不同颜色予以区分。

4.2 手套、口罩

一次性使用。怀疑手套被污染即应脱下,并更换新的手套。

4.3 鞋套、帽子

条件允许的情况下,建议使用鞋套、帽子。

5 样品处理

5.1 外包装处理

对于高致病性样品(如怀疑感染非洲猪瘟样品),应对外包装进行处理,流程如下:

收到样品后,除去最外层包装如泡沫箱(送样前已进行消毒),对内层外包装(如塑料袋、封口袋)喷洒0.8%氢氧化钠溶液,作用30min。为防止溶液干燥,需间隔10-15min再次喷洒,然后用纸巾擦干。

除去内层外包装,对最小包装(如抗凝管等)喷洒0.8%氢氧化钠溶液,作用30min。为防止溶液干燥,需间隔10-15min再次喷洒。然后用纸巾擦干。

5.2 样品灭活处理

某些高致病性样品(对人或动物),需要进行灭活后才能进行后续处理。液体样品需灭活后再进行后续操作,固体样品可在匀浆后进行灭活,然后再进行后续操作。

5.3 开放式操作

所有开放式操作,如倾倒、加样等,需在生物安全柜内操作。

5.4 抗凝血处理

对外包装消毒处理后,取出抗凝管,颠倒数次混匀管内液体,然后转移入离心管。

对于需要分离血浆的,以10000r/min离心5min,然后分离血浆,转入洁净离心管。

对于需要混样的,从待检样品中吸取一定量抗凝血或血浆,转入洁净离心管,做到每个样品换一个吸头。

5.5 拭子处理

观察离心管内残留保存液体积,如不足所需量可适当加入PBS液补足。单样检测的,可补至液体量500μL左右,混样检测的可补至200μL左右。

为避免交叉污染,不建议用镊子夹住拭子反复挤压方式处理拭子,推荐用涡旋后离心方式进行处理。具体操作方式:补足液体容量后,将离心管置于涡旋混匀器上涡旋1min,然后以10000r/min离心5min,吸取上清液200μL,转入洁净离心管

5.6 组织样品处理

采用多点取样方式,从组织不同部位剪取一定量样品,剪碎混合后取100mg左右置于匀浆管内(预先放入钢珠),加入PBS1mL,置于组织匀浆机进行匀浆。取出后以10000r/min离心5min,吸取上清液200μL,转入洁净离心管

注:对于RNA病毒,建议加入的PBS液进行预冷处理。且一次匀浆时间不宜过长,可分为几次处理,匀浆一次后取出置于冰水中冷却,然后进行下一次匀浆。

6 核酸提取

一般采用柱式提取或磁珠法提取,以柱式提取为例:

6.1 试剂准备

有些试剂盒需要自配无水乙醇、异丙醇或蛋白酶K等试剂,需提取准备好。

有些试剂盒内的部分试剂,在首次使用前需加入一定量的无水乙醇,按需要量予以补足。

有的试剂盒,含有冷冻保存的试剂(如蛋白酶K),需提前取出室温融化或适当水浴融化。

大多数小容量试剂(2mL以内),均需在使用前先进行瞬时离心,将试剂甩至容器底部。

部分试剂盒内附的洗脱液(如TE),对于后续PCR反应效果不佳。改用灭菌水洗脱时,应先将冷冻保存的灭菌水,提前取出室温融化或适当水浴融化。

注:灭菌水制备:(1)取洁净耐高温试剂瓶(如蓝盖玻璃试剂瓶),装入80%容量超纯水,盖上瓶盖稍旋几圈不要盖紧,置于高压灭菌器12130min,冷却后取出,盖紧瓶盖,置于药品冷藏箱暂存。(2)1.5mL洁净离心管,加入灭菌水约1mL,做好标记,冷冻保存。

6.2 裂解

加入裂解液对样品进行裂解。

样品排列时应注意保持一定的距离,离心管之间最少应间隔一个孔位,以避免离心管打开后,不同离心管盖内壁相互触碰造成交叉污染(下同)。

加液时注意吸头不要触碰到离心管任何部位,否则应更换吸头,并重新制备可能受到污染的样品。

放入和取出离心管时,宜用镊子操作,避免手直接接触离心管。

如果需要进行混匀操作,要尽量温和,一般采用颠倒10次的方式进行混匀。

如需水浴,应在实验开始前开启水浴锅提前预热,以免影响实验进度。水浴锅内的离心管架应经常消毒、清洗,避免交叉污染。

从水浴锅内取出离心管后,用纸巾擦干水分,置于原离心管架。

6.3 结合

待离心管内液体稍冷却后,将液体转移入吸附柱内,待反应几分钟后,以10000r/min离心1min,弃去收集管内液体。

转移液体时,可采取直接倒入,或用移液器转移,注意随时更换吸头。

液体转移入吸附柱后,应等待几分钟,以利核酸与吸附柱的膜充分结合。

弃去收集管内液体,可直接倒出,或用吸管吸出。如直接倒出,应将收集管倒置在纸巾上吸干液体,注意每支收集管在纸巾上的位置应不同。

离心时放入和取出离心管,宜用镊子操作,避免手直接接触离心管。

6.4 洗涤

分三次用洗涤液洗涤吸附柱,其中第一次为高盐洗涤液,后两次为低盐洗涤液。

操作注意事项基本同上。最后一次洗涤离心后,应将吸附柱与收集管(空管),以10000r/min离心2min,彻底去除液体。

因洗涤液含有较高含量乙醇,对后续的PCR反应有一定程度的影响。因此空管离心后,应打开收集管盖,静置5-10min,待乙醇充分挥发后再进行洗脱。

6.5 洗脱

将吸附柱置于洁净离心管上,加入洗脱液,2min后盖上离心管盖,剪去吸附柱盖,以10000r/min离心1min,离心管底部液体即为所提取的DNA/RNA

提取DNA时,可将洗脱液预热至60左右,提高洗涤效率。

加入洗脱液时,应注意尽量覆盖整个吸附膜,提高洗脱效果。

加入洗脱液后,应静置几分钟,让洗脱液与吸附膜上的核酸充分结合。

离心前应尽可能剪去吸附柱盖,避免吸附柱盖内壁与其他离心管及离心机部件接触造成交叉污染。

提取所得的DNA/RNA,应冷冻保存(建议保存于-70冰箱)。如需立即进行扩增的,可于当日冷藏暂存(不得过夜)。

7核酸扩增

核酸扩增试剂有多种:(1)单管试剂:所有组分混合在一管;(2)双管试剂:酶制剂单独为一管,其他试剂为一管,使用前按比例混合;(3)多管试剂:预混液、酶、引物、探针均单独一管,使用前需按照扩增体系临时配制。

不管何种试剂,使用方式大同小异,注意事项如下:

所有试剂使用前均需提前室温融化或适当水浴融化,并瞬时离心将试剂甩至管底;

吸取试剂时每次更换新的吸头(建议采用带滤芯吸头);

除单管试剂外,其余试剂建议先将所有组分的总量配制成混合液,瞬时离心后分配到PCR管内。

配制混合液时,试剂应增加适当余量:10份检测(含对照)多配0.5份,20份检测多配1份,20份以上检测多配5%。使用不同的移液器、离心管、吸头,余量不一样,可以先用灭菌水多次尝试后确定余量比例。

对于ABI7500荧光定量PCR仪,如试剂内不含ROX,建议自行加入,可在一定程度上减少反应孔间的差异。对于不同设备ROX浓度不一样,一般ABI7500应选用ROX II(低浓度)。

加入DNA/RNA时,应按阴性对照、待检样品、阳性对照顺序加入。

所有试剂及DNA/RNA加样完毕后,盖上PCR管盖,做好标记。轻摇PCR管混合所有成分(不建议DNA/RNA加样时吹打混合,极易造成移液器污染),瞬时离心后上机。

由于荧光定量PCR仪多采用Peltier进行控温,不可避免带入边缘效应,因此PCR管一般应放在升降温模块的较中间位置较好。热盖与升降温模块长期夹击之下,左右两侧的组件容易轻微变形,因此在可能的情况下,升降温模块左右两侧最好各放置一排洁净的空PCR排管,以降低组件变形的可能。

荧光定量PCR仪的升降温模块需进行一段时间的预热,才能达到较好的扩增效果,因此扩增时最好提高30min打开设备予以预热。灯泡、升降温模块都有一定的寿命,因此扩增结束后尽可能及时关机。

扩增产物尤其是阳性对照孔中,扩增片段的浓度非常高,特别是部分Ct值低于20的阳性对照。因此扩增结束后,应及时取出扩增产物PCR管,投入含氯消毒剂中,反应一段时间后弃去,切勿打开PCR管。

由于难免存在PCR管未盖紧或扩增过程中轻微裂开等因素,升降温模块可能会受到污染。因此在开展一段时间检测后,应使用棉签沾无水乙醇擦拭升降温模块各孔,并等待无水乙醇充分挥发后再进行扩增检测。
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