主题:【第十三届原创】酶标仪检测多糖

浏览 |回复1 电梯直达
Gao欣
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
维权声明:本文为Ins_baf5de7a原创作品,本作者与仪器信息网是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。

酶标仪检测多糖

    酶标仪检测多糖可以同时多组进样,进样量小,可以节省检测时间,节省样品量,效率高,准确度高。本文是针对多糖含量检测的三种方法:苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸比色法、35-二硝基水杨酸(DNS)比色法,使用酶标仪进行检测的实验方案。

苯酚-硫酸法测定苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物,再以比色法测定)

    一、实验试剂

    多糖(样品)、5%苯酚溶液、浓硫酸、葡萄糖

    二、实验仪器

        50ml容量瓶、量筒、玻璃棒、洗耳球、烧杯、20ml具塞试管

    三、实验步骤

    最大吸收波长的确定:分别取1mL葡萄糖标准溶液和多糖溶液于20mL具塞试管中,用去离子水补充至1.0mL。向试液中加入1mL 5%的苯酚溶液,然后迅速加入5.0mL浓硫酸(与液面垂直加入,勿接触试管壁),静止10min,使用漩涡振荡器充分混合,将试管置于30℃水浴锅中反应20min,同时以蒸馏水代替样液作空白,在400~500nm之间每隔10nm测定吸光度,确定最大吸收波长。

        1、标准曲线的绘制

  (1)取0.05g的葡萄糖于50ml容量瓶,加入蒸馏水溶解并稀释至刻度,再去5ml于50ml容量瓶,加蒸馏水稀释,即0.1mg/mL。

  (2)分别量取0,0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准葡萄糖液置于20mL具塞试管中,用去离子水补充至1.0mL。向试液中加入5%的苯酚溶液,然后迅速加入5.0mL浓硫酸(与液面垂直加入,勿接触试管壁),静止10min,使用漩涡振荡器充分混合,将试管置于30℃水浴锅中反应20min,在最佳波长下使用酶标仪测定吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,制定标准曲线。

      2、样品的测定

    取样品1.0mL于20mL具塞试管中,按照上述方法进行显色反应,于最佳波长下下测定吸光度,结合标准曲线计算多糖含量。(样品浓度:0.1mg/ml)

  蒽酮—硫酸比色法(糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后,与蒽酮(C14H10O)脱水缩合,形成糠醛的衍生物呈蓝绿色)

  一、实验试剂

  多糖(样品)、0.2%蒽酮硫酸溶液、葡萄糖

  二、实验仪器

      50ml容量瓶、量筒、玻璃棒、洗耳球、烧杯、20ml具塞试管

  三、实验步骤

  最大吸收波长的确定:分别取1mL葡萄糖标准溶液和多糖溶液于20mL具塞试管中,加入4.0mL质量浓度为2g/L蒽酮硫酸溶液,在沸水浴中加热5min,取出自来水冷却10min,同时以蒸馏水代替样液作空白,500800nm之间每隔20nm测定吸光度,确定最大吸收波长。

      1、标准曲线的绘制

  分别量取00.20.40.60.81.0mL标准葡萄糖液置于20mL具塞试管中,用去蒸馏水补充至1.0mL。加入4.0mL质量浓度为2g/L蒽酮硫酸溶液,在沸水浴中加热5min,取出自来水冷却10min,同时以蒸馏水代替样液作空白,在最佳波长下测定吸光度,绘制标准曲线。

      2、样品测定

  取样品1.0mL20mL具塞试管中,加入4.0mL质量浓度为2g/L蒽酮硫酸溶液,在沸水浴中加热5min,取出自来水冷却10min,于最佳波长下下测定吸光度,结合标准曲线计算多糖含量。(样品浓度:0.1mg/ml

    35-二硝基水杨酸(DNS)比色法3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质,还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系,在紫外光下测定棕红色物质的吸光值,查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量)

  一、实验试剂

  多糖(样品)、葡萄糖、DNS2mol/L NaOH溶液、酒石酸钾钠

  二、实验仪器

      50ml容量瓶、量筒、玻璃棒、洗耳球、烧杯、20ml具塞试管、50ml三角瓶

  三、实验步骤

      DNS试剂制备:DNS试液的配制
:称取6.3gDNS262ml浓度为2mol/LNaOH溶液。加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000ml,贮于棕色瓶中,7天后使用。

  总糖供试液和单糖供试液制备:精确称取2份多糖各50mg,分别置50mL三角瓶中,其中一瓶加10mL 6mol·L-1盐酸和15mL蒸馏水,置沸水浴中加热30min,取出,冷却至室温,加酚酞指示剂1,10%NaoH溶液中和至溶液微红色,过滤,滤液定容至100mL,摇匀,作为总糖供试液。另一瓶中加10mL蒸馏水,溶解,加酚酞指示剂1,10%NaoH溶液中和至溶液微红色,用水定容至100mL,摇匀,作还原糖供试液。

  最佳波长的确定:分别量取葡萄糖标准溶液(1mg/mL)、总糖供试液和单糖供试液各1mL1.5mLDNS试剂反应,同时以蒸馏水代替样液作空白,440680nm之间每隔20nm测定吸光度,确定最大吸收波长。

      1、标准曲线的绘制

  分别量取00.20.40.60.81.0mL标准葡萄糖液置于20mL具塞试管中,用去蒸馏水补充至2.0mL。每支试管中加入1.5 mLDNS试剂,混合均匀,于沸水浴中加热5min,取出后立即浸入冷水冷却至室温,再用蒸馏水定容至25ml刻度处,摇匀,于最佳波长下下测定吸光度,绘制标准曲线。

      2、样品的测定

  取多糖溶液1mL25ml具塞试管中,加入DNS试剂1.5mL,于沸水浴中加热5min,取出后立即浸入冷水冷却至室温,再用蒸馏水定容至25ml刻度处,摇匀,于最佳波长下下测定吸光度,结合标准曲线计算多糖含量。(样品浓度:0.1mg/ml

为您推荐
启航2021
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵