主题:【第十三届原创】荧光定量PCR实验失败原因分析——ROX设置不当

浏览 |回复4 电梯直达
栀子花开
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
解密双螺旋团队发表于:2020/06/05 21:04:19 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
维权声明:本文为qzxmsy原创作品,本作者与仪器信息网是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。
荧光定量PCR实验失败原因分析——ROX设置不当

这事发生在用荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒核酸的时候,作为荧光定量PCR实验失败的一个案例,写出来供大家借鉴。

1背景资料

201811月底,省疫控中心开展非洲猪瘟病毒核酸检测培训,随后进行检测资格授权所需的能力考核。因当时国内尚无商品化的非洲猪瘟荧光定量PCR检测试剂盒,采用的办法是qPCR预混液及下发的引物探针,考虑到系统内多数实验室的荧光定量PCR仪是ABI7500,同时还下发了ROX

2开展检测

培训结束后马上领样品回来检测,结果比较理想,顺利通过了能力考核,取得检测资格授权。随后对采集的样品开展检测,幸好均未检出非洲猪瘟阳性样品。

3实验失败

随着检测工作的发展,qPCR预混液即将用完,而商品化检测试剂盒也已有上市,遂改用商品化试剂盒检测。第一次改用试剂盒,慎重起见将原先能力考核的样品用于验证,结果实验失败,扩增曲线图如下:



4分析原因

回顾检测过程,核酸提取、反应体系配置、反应条件设置等均无问题,只是原来我们每次在反应体系中均添加ROX,在软件中也设置了ROX参照,这一次……我们尽管没有添加ROX,但还是习惯成自然,还是在软件中设置了ROX参照,会不会是这里设置不当?

说干就干,在软件中将参照物由ROX改为NONE,刷新一下结果,果然是参照设置不当造成的。

扩增曲线如下:



5讨论

对于ABI7500来说,添加了ROX,最好在参照中也设置为ROX,这样可以确保您获得均一的定量PCR实验结果。因为据介绍,使用ROX可以达到以下效果:

——校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发/冷凝而导致的信号改变;

——为故障分析提供一项强有力的诊断工具:每次循环采集参比染料信号,不受PCR反应影响;

——均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异;

——均一化校正批间体积差异,提供更连续一致的批间重复Ct值。

但在未添加ROX的情况下,ABI7500软件却千万不能将参照设置为ROX,否则会造成意想不到的后果。
为您推荐
dadgoh
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
dadgoh
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
Insm_12eaaa10
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
蛋挞公主
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵