本文主要介绍有关物质、含量、残留溶剂测定方法建立与验证。
（一）有关物质测定方法建立与验证
杂质谱分析的切入点依据制备工艺，分析潜在的工艺杂质
基于结构特征，分析可能的降解产物
通过强制降解试验，验证降解产物的存在与检出
与原研市售品的杂质情况对比研究，明确杂质异同
…
杂质检查常见方法介绍（1）固定相的选择a.根据特征研究的药物的特性选择合适填料的柱子。常用 RP-HPLC，色谱柱多选C18柱、C8柱、苯基柱、氨基柱也有;b.使用C18柱时，流动相有机溶剂％通常≥5％;流动相的pH值2～8 pH>8，溶解硅胶载体，宜选用耐碱填充剂，包覆聚合物、高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、非硅胶或有机-无机杂化填充剂pH<2，键合相水解脱落，宜选用耐酸性填充剂：有机-无机杂化填充剂、具有大体积侧链的二异丙基或二异丁基取代C18键合硅胶等c.注意不同品牌柱子在耐用性方面的研究：当杂质峰与主峰的分离情况不十分完美确定辅料峰的相对保留时间（用于定位扣除辅料的干扰）确定特定杂质的相对保留时间确定有关物质出峰完毕的保留时间d.当不同品牌而引起以上各因素不固定时，应在标准中注明品牌（2）流动相的选择a.尝试多种流动相b.结合杂质的性质－手性杂质－无紫外吸收杂质一般杂质（3）洗脱方式的选择等度洗脱梯度洗脱
极性大的化合物可能被掩盖，极性小的化合物难以被洗脱，甚至保留在柱上，可使用梯度洗脱法
（4）波长的选择－选择的原则是大部分主要杂质与主成分均在此波长下有吸收：二极管阵列法
－无紫外吸收或检测波长处吸收相差较大的多种化合物，有时在单一检测波长处不能检出
－兼顾各杂质吸收情况：特定波长检测特定杂质
－必要时，该用其它类型的检测器
有关物质方法验证内容系统适用性、专属性 、线性和范围、校正因子、精密度、准确度、检测限与定量限 、溶液稳定性 、耐用性
（1）系统的适用性①验证内容理论板数：反映柱效，首先决定色谱柱和流动相的选择是否合适，应符合规定分离度——应大于2.0或符合规定重复性——不大于2.0%（5%、10%）拖尾因子——0.8-1.2或符合规定②系统适用性溶液制备方法a采用杂质对照品将各个杂质对照品加入到主产物中，配成系统适应性溶液。b.采用混合对照品或纯度较差的原料药的方法对杂质数多或多组分的、分离难度大的品种，中检所提供混合杂质对照品，多组分对照品及标准图谱，可以较好地保证分离的重现性。c.通过化学处理或其它方式产生杂质，应注意反应条件的优化，按面积归一化法计算主杂质占5%-10%为佳。d.采用其它方法制备系统适用性试验用样品。采用结构性质相近的标志性物质。如无法长期获得该杂质对照品时，采用相对保留时间定位。如能在标准中列出主成分的保留时间、色谱柱规格，可增强此法的可操作性。但此时，应特别注意色谱条件的耐用性考察。在梯度洗脱的色谱系统中为保证方法的重现性，应对主峰的出峰时间进行规定。③拖尾因子对于在色谱系统中峰型非正态型的色谱峰规定该色谱峰的拖尾因子是很有意义的，以保证色谱峰不会因拖尾严重，而导致杂质峰包裹在主峰中未被检出。④报告限通过规定小于对照溶液主峰面积的一定量的色谱峰可忽略不计，这样可保证积分参数设置的合理性和一致性。⑤灵敏度试验通过配制灵敏度试验溶液（主成分浓度一般与报告限一致），并规定灵敏度试验溶液中主成分的信噪比，可以更好地保证方法的重现性、灵敏度和测定结果的准确性。（2）专属性指在可能的共存主分存在时，对被分析无物准确测定的能力
①验证内容a.空白溶剂和空白辅料干扰试验b.中间体、降解物及其它已知杂质与主成分定位及分离度试验(注意浓度)c.降解试验：酸降解（盐酸）、碱降解（氢氧化钠溶液）、氧化（过氧化氢）降解、光降解、高温降解；如有辅料，同时进行降解比对d.粗品考察②降解试验a.降解条件酸：1.0mol/L盐酸碱：1.0mol/L氢氧化钠氧化：10%双氧水高温：60℃或80℃水浴光照：4500Lxb.降解关注点适宜降解（10%）峰纯度降解回收率（物料平衡，98.0%～102.0%）③强制降解终止条件暴露至至少有10%的样品被降解 (回收率为90%) 或者达到最长的放置时间。最长的暴露时间由回收率测定。如果样品在特定条件下暴露48小时后的回收率仍然>90%，则可判定该强制降解条件不是主要的降解途径。如果样品在暴露48小时前便已经降解至回收率< 90%，则可判定降解的终点已经达到，需终止降解。降解物质要根据ICH的要求定出标准并作鉴别④专属性方法验证的指标分离度：专属性指标、杂质谱的明确是基础方法不够专属时，应多个方法予以补充（3）线性与范围主药及已知杂质，至少5个浓度，以限度浓度为中间浓度，向两边梯度延伸（从定量限浓度起至杂质限度浓度的120%或更高）。接受标准：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。（4）校正因子线性斜率法和等浓度法，首选线性斜率法，0.9～1.1认为一致（实际工作中放宽至 0.8～1.2）。（5）精密度①重复性无已知杂质的：配制成自身对照限度浓度，由同一人员在相同操作条件下，连续进样6次，计算RSD，或测定供试品溶液，同前操作，计算杂质总量及已知典型杂质的RSD；接受标准：RSD不得大于10%。有已知杂质的：标准加入配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，同前操作，计算该杂质的RSD；接受标准：RSD不得大于15%。②中间精密度供试品同前，由不同人员，在不同时间，使用不同仪器，按照测定法测定同一样品的有关物质，计算RSD（简化：分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据计算 RSD）；接受标准：RSD不得大于20%。（6）准确度无已知杂质的，可不做；已知杂质的加样回收试验。限度浓度为中间值（100%），3个浓度，每个浓度（定量限以上浓度，越低越好；100%；150%或200%）各3份（共9份）。接受标准：各浓度下的平均回收率均应在 80%-120%之间（如低浓度点为定量限，则可放宽至70%-130%）；相对标准差应不大于10.0%。（7）检测限与定量限采用信噪比法，S/N≥3及S/N≥10；另外，配制6 份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰及杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。(8)溶液稳定性考察时间：与测定周期相适应，一般不少于8h；室温或控制温度（如：4℃）、或避光等条件下，考察供试品溶液的主要杂质及总杂质峰面积变化并计算 RSD。做的更好：同时取自身对照溶液及已知杂质限度溶液同法考察；接受标准：主成分的含量变化的绝对值应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。后处理：不稳定的应注明立刻进样或规定放置时间。(9)耐用性①流动相pH：水相缓冲液的pH波动范围±0.2（EP规定非缓冲盐为±1.0，感觉不太符合CDE的高标准）；缓冲液盐浓度：在满足pH值条件下，缓冲液中盐的浓度波动范围在±10%；流动相的组成调整限度适用于流动相中的小组分（比例小于等于50%）。这些组分的量可在正负30%范围内调整。但是不能超过总流动相的10%（三相系统可分别对较少的2相单独进行调整，如：三相体系：溶剂比为60:35:5时，第二组分35的30%时 10.5%，超过10%的限度，只能在25%到45%的范围内改变。第三组分5的30%是1.5%。加上组分一共同构成洗脱体系。因此三相体系的比例变化范围是50:45:5到70:25:5或者58.5:35:6.5到61.5:35:3.5）（EP中还有±2.0%的规定，但流动相组成ChP与USP完全一致，故按USP操作）(实际规定为±5％，也认可)；②柱温柱温波动范围在±10℃（实际柱温变化±5℃，也认可）；③流速流速可变范围是±50%（实际变化±20％，也认可）。特别提醒：色谱柱尺寸改变时，规定流速需进行转换，计算：F2=F1L2d22/L1d12（F1是文件中规定的流速，单位是mL/min，F2是调整后的流速；L1是文件中规定的柱长，L2是使用柱长；d1为文件中规定的柱内径，d2为使用柱内径）；④色谱柱不能改变固定相填料类型（例如不能用C8柱替换C18柱）及特殊改性技术（如采用AQ C18代替普通C18）。采用三根不同批号（标准中需制定品牌时）、或品牌、或规格；可变参数如下：（一般只推荐改变柱长，其余验证时不推荐）柱长：可变范围为原柱长的±70%（USP）及±50%（EP）；柱内径：可调范围±25%；粒径：填料颗粒尺寸可以减小50%，但是不能增大）的色谱柱进行考察；⑤检测波长和进样量检测波长选定后，耐用性验证时不能改变（仪器校验允许误差：±3nm）；进样量选定后，耐用性验证时一般不验证，如需要，在满足检测限和重现性的情况下可减少进样体积，但不能增加进样体积⑥要求与接受标准a.每个条件下各测试两次b.各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内有关物质检查研究主要存在的问题对有关物质认识不全面:无论经过多少步反 应一般只考察1～2 个前体物质，其他不予 考虑。其实对杂质的检查可以选择多种体 系(2～3 种) ，选择适宜的体系对主要杂质 进行检测。
未考虑反应的副产物和降解产物
方法学研究不深入，往往不能保证方法的 专属性及可靠性。象专属性研究不全面； 套用含量测定的方法；进样量不够；纪录 时间太短；图谱不符合要求等。
以TLC 方法进行检测居多，虽然方法简便， 但因为重现性、精确度与HPLC 法比较受到 限制，往往不能很好分离杂质。
制剂的有关物质检查，可以采用原料药的 方法，但制剂过程比较复杂，影响因素较 多，应考察方法的专属性，看辅料是否干 扰，全面考察制剂工艺、制剂稳定性情况， 考虑制定制剂的有关物质检查方法和限度 要求。
如果仿制国外的新药，不仅要进行结构确 证比较，还应进行杂质检测的对比，比较 个数、量，最好能明确是何种物质。生产 工艺(反应条件、精制条件) 的不一致，会导 致杂质数、量不同，不能盲目照搬国外的 标准来控制某个杂质或溶剂。
（二）含量测定方法建立与验证
含量测定分析方法验证内容(1)
系统适用性(2)
专属性(3)
线性和范围(4)
精密度(5)
准确度(6)
定量限(7)
溶液稳定性(8)
耐用性（1）系统适用性 RSD ≤2.0%，其余同有关物质（2）专属性特殊杂质与主成分完全分离，溶剂、辅料无干扰。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。（3）线性和范围主药浓度的80%～120%，至少5个浓度，回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内， 响应因子的相对标准差≤2.0%。
（4）精密度重复性：同一人员，相同操作条件，连续测定同一份样品6次，RSD≤2.0%
中间精密度 ：不同人员，不同时间，不同仪器，测定同一 样品各6次，RSD≤2.0%
（5）准确度配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。各浓度下的平均回收率均应在98.0%～102.0%，RSD（n=9）≤ 2.0%。制剂采用辅料中加对照品法，原料可以采用加样回收率法。（6）溶液稳定性考察时间：与测定周期相适应，一般不少于8h；室温或控制温度（如：4℃）、或避光等条件下，考察供试品溶液的主要杂质及总杂质峰面积变化并计算RSD。如不稳定：临用新配或配制好后在n小时内进样测定（7）定量限以SN≈10进行考察，关注方法的灵敏度。（8）耐用性流动相的组成的比例、PH值、不同厂牌的柱子、柱温、 流速等
要求：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的RSD（n=9）≤ 2.0%。含量测定——方法的选择原料药：纯度达到98.5％以上时，应尽量选用容量分析方法；一般避免采用UV法，必要时，应用对照品同时测定。制剂：应优先选用专属性强的方法。高效液相色谱法应重点用于有杂质干扰现象、常规方法难以分离或分离手段繁杂的品种。采用HPLC法时，一般建议用外标法。建立HPLC含量测定方法时，如可能应进行峰纯度检查。起草说明中应有峰纯度检查结果。含量测定——样品的制备如样品为难溶样品，建议在标准中规定取样量、溶剂体积、溶解方式及稀释步骤，而避免笼统地描述为 一定浓度的溶液，使标准有更强的可操作性（在产品 处于合格边缘时，可更准确地评价其不确定度）。
举例：含量测定方法学验证总结| 项目 | 验证结果及结论 |
| 专属性 | （1）稀释液或流动相与主成份之间达到良好分离；
（2）强制破坏性（热、光照、氧化、酸、碱）试验下主峰峰纯度≥98.0%，降解产物和主成分达到良好分离 |
| 线性和范围 | 在0.03-32mg/ml范围内线性良好，r2=0.9997 |
| 定量限 | 3ug/ml，符合检测需要 |
| 准确度 | 在80%-120%浓度范围内，平均回收率为98.7-101.3%，RSD为0.53- 1.21%，符合98%-102%、RSD<2%的要求 |
| 精密度 | 仪器精密度、重复性、中间精密度均≤2% |
| 溶液稳定性 | 样品溶液在室温下放置24小时含量测定结果为99.0-101.0%，表明溶液在室温下放置24小时稳定。 |
| 耐用性 | 柱温、流动相、检测波长进行微小调整，对检测结果无影响，方法耐用性较好 |
（三）残留溶剂的方法学验证
（1）线性与范围至少5个浓度，以限度浓度为中间浓度，向两边梯度延伸（从定量限浓度起至限度浓度的120%或更高）。接受标准：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。（2）检测限与定量限采用信噪比法，S/N≥3及S/N≥10；另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，各溶剂峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于10%。（3）耐用性固定相粒径：(填充柱)，粒径由大换小或者由小换大都可以（EP：可减少50%，不能增大粒径尺寸）薄膜厚度：(毛细管柱)可调范围从-50%到+100% 色谱柱尺寸：长度：可调范围±70%内径：可调范围±50%流速：±50%柱温：恒温：±10%；程序升温：温度可做适当改变，需要保持一定温度或者改变到另一温度值时，温度变化做大容许范围是±20℃进样口温度：±10℃进样体积和分流体积：在满足检测限和重现性的情况下可做适当调整申明：本文为本人结合各大指导原则、相关培训资料及日常经验总结整合资料，仅供参考，欢迎交流！
