主题:【第十三届原创】超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中维生素A、D的含量

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hujiangtao
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7月二等奖
超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中维生素A、D的含量

摘要:采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了检测奶粉中维生素AD含量的分析方法。试样经氢氧化钾-乙醇皂化反应后,正己烷提取,氮气吹干后用甲醇定容,维生素ADC18色谱柱上以0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相,进行液相色谱分离;质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式(MRM)。结果表明,维生素AD在各自浓度范围内线性关系良好,相关系数(r)大于0.999,定量下限(LOQ)分别为105 ug/kg,加标回收率为87.2%~110%,相对标准偏差(RSD)为2.3%~5.2%n=6)。本方法简便、灵敏、准确,适用于奶粉中维生素AD含量检测

关键词:超高效液相色谱-串联质谱;奶粉;维生素AD



维生素在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用,是人类为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质。根据溶解性质不同,分为水溶性维生素(如B族维生素、维生素C等)和脂溶性维生素(如维生素ADEK等)。维生素AD对人体视觉能力、免疫力、骨骼生长发育等方面都有重要的生理功能,但这类物质在人体内不能合成或合成量不足,必须经常由食物供给,因此维生素AD被广泛添加在作为人类获取营养物质食物来源之一的奶粉中(特别是婴幼儿配方奶粉),但研究也表明若过量摄入,也会对人体造成危害,所以准确检测奶粉中维生素AD含量十分重要。

目前,食品安全国家标准《GB 5009.82-2016 食品中维生素ADE的测定》中规定的维生素A测定是液相色谱法,维生素D包括液质联用法和制备-液相色谱法。用该标准检测维生素A和维生素D时,需要把样品分开进行两种前处理,费时费力费试剂,而且由于奶粉中蛋白脂肪含量较高,用液相色谱法检测维生素A时基质干扰较大,可能造成定量不够准确。而不少研究表明,维生素ALC-MS/MS上响应很好,同时MRM模式能有效去除杂质干扰,定量更加准确可靠。本文借鉴GB 5009.82-2016的造化过程,通过后续优化提取步骤,最终选用正己烷作为造化后溶液中维生素AD的共同提取试剂,实现了利用LC-MS/MS法一个前处理可以同时测定维生素AD该方法前处理过程简便、分析时间短、灵敏度高、抗干扰能力强,适用于大批量奶粉样品中维生素AD含量的检测。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

维生素A、维生素D2、维生素D3标准品(纯度99%Sigma公司);婴儿配方乳粉定量分析质控样品(QC-IP-704,中国检验检疫科学研究院);正己烷、甲醇、乙酸乙酯、甲酸(色谱纯,Fisher公司);无水乙醇、氢氧化钾、抗坏血酸(优级纯,科密欧公司);硅胶固相萃取柱(500 mg6 mLWaters公司);实验用水为Millipore纯水仪制备。



1.2 仪器与设备

UPLC XEVO TQ-S超高效液相色谱串联质谱仪(Waters公司);水浴振荡器;涡旋混合器;氮吹仪。

1.3 维生素AD2D3标准储备液的配置

分别称取一定量的维生素AD2D3标准标准品,用无水乙醇配置成质量浓度为100 ug/mL标准储备液,于-20℃冰箱保存(有效期1个月),待用;临用前将溶液回温至室温,并按照GB5009.82-2016附录B表格进行浓度校正,然后用甲醇逐级稀释成所需浓度的标准工作液。

1.4 样品前处理

准确称取2.00 g(精确到0.01 g)奶粉试样于150 mL三角瓶中,加入100 uL 1 ug/mL维生素D2-d3D3-d3混合内标混匀,静置30 min,然后依次加入0.5 g抗坏血酸、40温水10 mL,涡旋混匀;加入20 mL无水乙醇混匀,再加入10 mL 50%氢氧化钾溶液涡旋混匀,放入恒温振荡器中55℃避光水浴震荡皂化60 min,皂化后立即用冷水冷却至室温

将皂化液转入250 mL分液漏斗中,加入20 mL正己烷,轻轻摇动震荡萃取5 min后静置分层,将下层溶液转移至另一分液漏斗中按上述方法再次提取,合并有机相,水洗至中性,将洗涤后的正己烷层通过无水硫酸钠过滤脱水,收集滤液待用。

a)维生素A测定:准确吸取2 mL上述滤液于试管中,氮气吹干后加入1 mL甲醇定容,涡旋混匀后过0.22m有机系微孔滤膜后供UPLC-MS/MS分析测定;

b)维生素D测定:将硅胶固相萃取柱依次用8 mL乙酸乙酯活化、8 mL正己烷平衡,准确吸取20 mL上述滤液全部过柱,再用6 mL乙酸乙酯-正己烷(5+95)淋洗,用6 mL乙酸乙酯-正己烷(15+85)洗脱收集。洗脱液用氮气吹干后加入1 mL甲醇定容,涡旋混匀后过0.22m有机系微孔滤膜后供UPLC-MS/MS分析测定。

注意:因维生素容易受到光照影响,在整个前处理操作过程中注意避光,前处理完成后尽快上机测定。

1.5 液相色谱及质谱条件

液相色谱:色谱柱:Waters BEH C181.7 μm50mm×2.1mm);柱温:30;流速:0.4 mL/min;进样量:2μL;流动相A:甲醇;流动相B0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0~0.5min90% A0.5~2. 0 min90%~100% A2. 0 ~4. 0 min100%A4 ~4.1min100% A~90% A4.1 ~5.0min 90% A

质谱:离子源:电喷雾离子源( ESI + ) ;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测( MRM);毛细管电压:3.2 kv;离子源温度:150℃;去溶剂气温度:500℃;去溶剂气流量:1000 L /h;定性、定量离子对及碰撞能量见表1

﹡为定量离子

2 结果与讨论


2.1 色谱质谱条件及前处理过程的优化

流动相的选择:对比了酸性体系(0.1%甲酸水溶液)与甲醇、乙腈的流动相体系组合,结果发现目标物在乙腈体系中容易造成出峰时间较长导致峰宽变大,而在甲醇体系中响应值比乙腈高很多,且峰型得到明显改善,故本研究采用0.1%甲酸水溶液+甲醇流动相体系。

质谱参数优化:用甲醇配置1.0 mg/L 维生素AD2D3标准溶液直接注射到质谱中,在正离子模式下进行母离子全扫描,发现目标物各自对应的准分子离子峰[M+H]+具有很好的响应,然后在分别进行子离子全扫描,各得到两对丰度高、干扰小的子离子对进行MRM监测,最终确定的质谱条件见表1,相应的色谱质谱图见图1、图2

前处理过程优化:通过实验发现,将皂化液用正己烷提取后直接氮气吹干定容上机,维生素D2D3图谱有很大干扰,容易影响定量准确性;而正己烷提取液经硅胶固相萃取柱净化,用乙酸乙酯-正己烷(5+95)淋洗,然后再用乙酸乙酯-正己烷(15+85)洗脱收集氮吹后测定能有效去除杂质干扰,使VD定量更加准确。同时在使用硅胶固相萃取柱测定VA柱效时发现,使用乙酸乙酯-正己烷(5+95)淋洗液会使一部分VA从柱子洗脱下来造成损失,可能是由于VA极性相对VD要强一些,更容易被乙酸乙酯洗脱,但不加乙酸乙酯不能有效去除杂质对VD的干扰,考虑到VA质谱响应比VD高很多,且在1.5液相条件下VA保留时间相对靠前,基线干扰较少,故本实验最终采用了1.4的前处理方法。


2.2 线性范围和定量限

吸取不同体积的维生素AD2D3标准储备液(1.3),用甲醇分别配置不同浓度的上机标准溶液,以各自定量离子的峰面积(或与内标峰面积比值)为Y对应质量浓度Xmg/L)做标准曲线,得到的线性方程和相关系数见表2;以10倍信噪比(S/N)计算得到各维生素的定量下限,结果见表2


2.4回收率和精密度

脂溶性维生素在奶粉中天然存在,查阅相关资料发现脱脂奶粉中VAVD含量较低,故本方法准确度实验采用脱脂奶粉作为空白样品进行加标。具体添加水平为:VA10100500 ug/kgVD2VD3550200 ug/kg每个水平重复6次,同时做该脱脂奶粉的空白本底实验。按照1.4前处理方法处理后上机检测,回收率计算结果(扣除空白后)见表3。结果表明,该方法维生素AD2D3的平均回收率为87.2%~110%,相对标准偏差(RSDn=6)为2.3%~5.2%,均满足实验要求。


2.5实际样品分析

为进一步验证该方法的准确性,采用本方法测定中国检科院的奶粉质控样品QC-IP-704,结果见表4;采用本方法对市场上不同品牌的婴幼儿配方奶粉进行检测,结果显示均未检出维生素D2,维生素AD3含量均符合《GB 10765-2010 食品安全国家标准婴儿配方食品》的规定。


3 结语

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定奶粉中维生素AD2D3含量的分析方法。该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度,前处理步骤简单,分析速度快,特别适合大批量样品的检测。

参考文献:

[1]GB 5009.82-2016 食品中维生素ADE的测定.

[2] GB 10765-2010 食品安全国家标准婴儿配方食品.

[3]严丽娟,李文斌,洪煜琛,. 液相色谱-大气压化学电离串联质谱法测定婴幼儿配方奶粉中的维生素D [J]. 色谱, 2017 , 04 :427-431.

[4]黄百芬,柯星,郑菲菲,. 固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定婴幼儿配方食品中维生素D2D3 [J]. 中国卫生检验杂志, 2014 , 22 :3203-3207.

[5]赵孔祥,娄婷婷,何佳,. 同位素稀释/液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素[J]. 分析测试学报, 2015 , 12 :1372-1376.

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zyl3367898
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hujiangtao
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原文由 zyl3367898(zyl3367898) 发表:
2.2后面直接是2.4,没有2.3。
我都没注意,谢谢张老师指正^_^
问题123
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请问老师前处理怎么有效避光呢,有什么好的措施吗?
hujiangtao
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原文由 问题123(v2857333) 发表:
请问老师前处理怎么有效避光呢,有什么好的措施吗?
我们前处理时在阴面房间 拉窗帘,我觉得只要不是阳光直射应该问题不大
yy_0324
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