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在反相高效液相色谱分析中,选择正确的缓冲液PH值,对可离解的化合物分析的重现性十分重要
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在反相液相色谱分析中,流动相的PH值一般在2.5-7之间,当被分析物在反相条件下可离解,或样品的PH值在2.5-7之外时,就需要缓冲液。
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在选择缓冲液PH值之前,应先了解被分析物的Pka,高于或低于Pka两个PH值单位的,有助于获得好的、尖锐的峰,从HH公式:PH=Pka+log([A-]/[A])得知,溶液PH值高于或低于Pka两个单位,化合物中99%以一种形式存在,而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。
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为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的,离子对试剂例如四丁基铵的盐,十四烷基磺酸钠等,在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对,在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。
hujiangtao
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正确选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰,捡出限,以及获得稳定的保留时间十分重要,如果你知道化合物官能团信息和化合物的Pka值这一过程将十分简单。
hujiangtao
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由于可离解化合物的选择性依靠PH值,所以变化PH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团,如果PH值变小,出峰便快,则化合物中可能存在氨基,当PH变大,化合物出峰很快,或流出在死时间处,化合物可能是一种羧酸,因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。
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多数用于反相色谱的固定相都是天然的疏水物质,因此,分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小来分离的,含有疏水的机制也能以同样的保留方式分离。
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非常疏水的样品基质如玉米油,高芳香物质,和蜡能粘住固定相装填表面并且改变他们的性质。含有蛋白质物质的生物流体也能吸附在装填表面。尽管分析者想尽最大努力来保护HPLC柱子,某些分析物-基质污染能使固定相受到有害的影响。
hujiangtao
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保留时间不重现有两种不同的情况:即保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向发生变化,而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。
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