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2020/8/11 17:02:47 391楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

模板（靶基因）核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

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2020/8/11 17:02:55 392楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

Mg2 浓度　Mg2 对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2 浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

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2020/8/11 17:03:02 393楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

标准的PCR过程分为三步（如图所示）：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，

氢键断裂，形成单链DNA

2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与

DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活

性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延

伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

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