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2020/8/11 17:05:17 411楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
克隆PCR产物的最优条件是什么？

最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液，50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。
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2020/8/11 17:05:25 412楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
PCR产物是否需要用凝胶纯化？

如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
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2020/8/11 17:05:49 413楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？

A）涂布未转化的感受态细胞。

如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。

B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。

例如，将1ug/ul质粒1:100稀释，1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：

1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug

转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞

如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。

C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。

D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug），按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑，没有菌落或少有菌落，连接有问题。
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2020/8/11 17:05:59 414楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。

B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。

C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。

D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。

E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。[1]
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2020/8/11 17:06:38 415楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
核磁共振是磁矩不为零的原子核，在外磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程。核磁共振波谱学是光谱学的一个分支，其共振频率在射频波段，相应的跃迁是核自旋在核塞曼能级上的跃迁。
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2020/8/11 17:06:46 416楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
核磁共振应用:核磁共振成像(MRI)检查已经成为一种常见的影像检查方式，核磁共振成像作为一种新型的影像检查技术，不会对人体健康有影响，但六类人群不适宜进行核磁共振检查:即使安装心脏起搏器的人、有或疑有眼球内金属异物的人、动脉瘤银夹结扎术的人、体内金属异物存留或金属假体的人、有生命危险的危重病人、幽闭恐惧症患者等。不能把监护仪器、抢救器材等带进核磁共振检查室。另外，怀孕不到3个月的孕妇，最好也不要做核磁共振检查。
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2020/8/11 17:06:53 417楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
核磁共振（NMR，Nuclear Magnetic Resonance）是基于原子尺度的量子磁物理性质。具有奇数质子或中子的核子，具有内在的性质：核自旋，自旋角动量。核自旋产生磁矩。NMR观测原子的方法，是将样品置于外加强大的磁场下，现代的仪器通常采用低温超导磁铁。核自旋本身的磁场，在外加磁场下重新排列，大多数核自旋会处于低能态。我们额外施加电磁场来干涉低能态的核自旋转向高能态，再回到平衡态便会释放出射频，这就是NMR讯号。利用这样的过程，我们可以进行分子科学的研究，如分子结构，动态等。
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2020/8/11 17:07:00 418楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1930年代，伊西多?拉比发现在磁场中的原子核会沿磁场方向呈正向或反向有序平行排列，而施加无线电波之后，原子核的自旋方向发生翻转。这是人类关于原子核与磁场以及外加射频场相互作用的最早认识。由于这项研究，拉比于1944年获得了诺贝尔物理学奖。1946年，费利克斯?布洛赫和爱德华?珀塞尔发现，将具有奇数个核子（包括质子和中子）的原子核置于磁场中，再施加以特定频率的射频场，就会发生原子核吸收射频场能量的现象，这就是人们最初对核磁共振现象的认识。为此他们两人获得了1952年度诺贝尔物理学奖。
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2020/8/11 17:07:08 419楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
人们在发现核磁共振现象之后很快就产生了实际用途，化学家利用分子结构对氢原子周围磁场产生的影响，发展出了核磁共振谱，用于解析分子结构，随着时间的推移，核磁共振谱技术从最初的一维氢谱发展到13C谱、二维核磁共振谱等高级谱图，核磁共振技术解析分子结构的能力也越来越强，进入1990年代以后，发展出了依靠核磁共振信息确定蛋白质分子三级结构的技术，使得溶液相蛋白质分子结构的精确测定成为可能。
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2020/8/11 17:07:14 420楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
另一方面，医学家们发现水分子中的氢原子可以产生核磁共振现象，利用这一现象可以获取人体内水分子分布的信息，从而精确绘制人体内部结构，在这一理论基础上1969年，纽约州立大学南部医学中心的达马迪

安通过测核磁共振的弛豫时间成功地将小鼠的癌细胞与正常组织细胞区分开来，在达马迪安新技术的启发下纽约州立大学石溪分校的物理学家保罗?劳特伯尔于1973年开发出了基于核磁共振现象的成像技术（MRI），并且应用他的设备成功地绘制出了一个活体蛤蜊地内部结构图像。劳特伯尔之后，MRI技术日趋成熟，应用范围日益广泛，成为一项常规的医学检测手段，广泛应用于帕金森氏症、多发性硬化症等脑部与脊椎病变以及癌症的治疗和诊断。2003年，保罗?劳特伯尔和英国诺丁汉大学教授彼得?曼斯菲尔德因为他们在核磁共振成像技术方面的贡献获得了当年度的诺贝尔生理学或医学奖。
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