主题:【第十三届原创】化妆品中壬二酸的检测方法优化

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鹤壁农检联合队发表于:2020/09/10 14:48:59 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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化妆品中壬二酸的检测方法优化



壬二酸是非常有特点的原料,能同时用于祛斑和祛痘,用于重度的色素沉淀,如雀斑,黄褐斑,黑皮病等有非常明显的效果。检测壬二酸的方法包括:(1)三氟化硼-乙醚衍生气相色谱法检测(2)容量分析法(3)硫酸甲醇衍生气相色谱-质谱联用分析(4)将壬二酸衍生为对溴苯乙酮二酯,采用高效液相色谱法检测。考虑到壬二酸熔点为98~103℃,沸点为286℃(100mmHg),不易气化;容量分析法测定时的干扰比较大,不能精确测定化妆品中的壬二酸含量,采用衍生的方法,将壬二酸转化给酯类,通过色谱柱进行分离,火焰离子化检测器检测,灵敏度高,分离度好。故本研究拟建立通用性及操作性强、快速简便的前处理方法,利用气相色谱法准确测定化妆品中的壬二酸。

壬二酸别名杜鹃花酸,是从从卵圆形糠秕孢子菌培养液中分离出的含有9个碳原子的天然饱和直链二元酸,化学结构式为HOOC-(CH2)7-COOH,分子量188.22

仪器方法的建立

1. 色谱条件的优化

(1)色谱柱的选择

壬二酸衍生物经质谱确认为壬二酸二乙酯,根据壬二酸二乙酯的性质,选择了HP-5(30m×0.25mm×0.25μm),DB-1(60m×0.53mm×1.0μm),DB-624(60m×320μm×1.8μm),CP-WAX(50m×0.25mm×0.2μm)四种色谱柱作为目标物的预选分离柱,进行了实验,实验结果见下图。



图1  HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)





图2  DB-1(60m×0.53mm×1.0μm)



图3  DB-624(60m×320μm×1.8μm)



图4  CP-WAX(50m×0.25mm×0.2μm)

壬二酸衍生物在四种色谱柱上的峰宽及对称因子见下表:表1色谱峰峰宽和对称因子



结合壬二酸衍生物在不同色谱柱上的色谱峰峰形、峰宽及对称因子,选择HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)用来分离,峰展宽小,对称性好。

通过实验,最终确定色谱条件如下:

a)色谱柱:HP-5(30m×0.25mm×0.25μm),或性能相当色谱柱;

b)升温程序:80℃(保留2min),20℃/min升温至250℃,保持6min;c)进样口温度260℃;d)分流比5:1;

e)检测器温度280℃,氢气流量30mL/min,空气300mL/min。

(2)阳性样品质谱确认:将壬二酸衍生产物和壬二酸二乙酯标准物质进行质谱分析,分别得到壬二酸衍生物质和壬二酸二乙酯总离子流图和质谱碎片图,通过总离子流图的目标峰保留时间与质谱碎片图进行比较,确认壬二酸衍生后物质为壬二酸二乙酯。壬二酸二乙酯标准物质经质谱确认后总离子流图与质谱图如下:



图5  壬二酸二乙酯标准物质总离子流图



图6    壬二酸二乙酯标准物质碎片图

衍生物经质谱确认后总离子流图如下:



图7  壬二酸衍生物总离子流图



图8  壬二酸衍生物碎片图

通过对比目标峰的保留时间和质谱碎片图,确认壬二酸衍生物为壬二酸二乙酯。

必要条件下,对于阳性样品可以进行质谱确认,推荐条件如下:

f)色谱柱:HP-5ms(30m×0.25mm×0.25μm),或性能相当色谱柱;

g)升温程序:80℃(保留2min),20℃/min升温至250℃,保持6min;

h)进样口温度260℃;

i)分流比50:1;

j)电离方式:EI

k)MS检测器温度230℃;

l)传输线温度280℃;

m)扫描离子范围50-550amu;

n)载气:氦气,1.0mL/min

前处理方法的研究

试样衍生条件的选择与确定

(1)壬二酸衍生试剂选择

壬二酸熔点为98~103℃,沸点为286℃(100mmHg),考虑直接在气相色谱检测,将壬二酸标样用乙醇溶解,配制成200mg/L,400mg/L,600mg/L,800mg/L,1000mg/L五个点,直接上机分析,得到壬二酸标准曲线,线性如下图所示。由图可见,所得标准曲线的X轴截距非常大,造成这个结果的原因可能是由于壬二酸在色谱柱升温过程中发生了分子间聚合反应,导致低浓度点的壬二酸无法检出,所以,壬二酸不能直接上机分析,需进行柱前衍生。



图9  非衍生条件下标准曲线图

考虑到壬二酸有两个羧基,采用衍生成酯类物质的方法,衍生物更稳定,更容易检测。因此,考虑用酯化试剂或酰化试剂将羧基转为酯类。因为化妆品中普遍有水相存在,三氟化硼乙醚络合物不适于做为酰化试剂,而考虑硫酸甲醇、硫酸乙醇、氢氧化钾甲醇、氢氧化钾乙醇作为酯化衍生试剂。取空白样品,加入200mg/L的壬二酸标样在同样条件下,进行衍生反应试验,得到的衍生物谱图如下:



图10  不同衍生试剂的衍生物色谱图

上图中,红色为硫酸甲醇作为衍生试剂得到的衍生产物,经质谱确认衍生物为壬二酸二

甲酯;绿色为硫酸乙醇衍生物,经质谱确认衍生物为壬二酸二乙酯;氢氧化钾甲醇和氢氧化

钾乙醇衍生后,均无衍生物产生。同样条件下,硫酸乙醇衍生物峰面积大,响应值高,而且

乙醇毒性小,因此,选择硫酸乙醇作为壬二酸衍生试剂。

(2)衍生试剂用量选择

取1g试样,加入同样体积的壬二酸标准溶液,加入2mL乙醇,分别加入浓硫酸50μL、100μL、200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL、1200μL、1400μL、1600μL、1800μL、2000μL进行衍生,衍生物含量见下表。

表2  衍生试剂浓硫酸用量对衍生结果的影响





可以得出,随着浓硫酸加入量的增加,衍生物含量逐渐加大,在硫酸加入量为800-1200μL时,衍生物浓度最大;随着硫酸加入量再进一步加大,衍生物的浓度逐渐下降,因此,选择硫酸加入量为800μL比较适宜。

(3)衍生温度的选择

取1g试样,加入同样体积的壬二酸标准溶液,加入2mL乙醇,加入浓硫酸800μL,分别在室温、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下进行衍生实验,考察温度对衍生过

程的影响,结果见下表。

表3  衍生温度的选择



在室温到40℃范围内,衍生物的含量变化不大,随着衍生温度的逐渐升高,衍生物浓度逐渐下降,在反应温度为70-80℃左右时,衍生物含量变化不明显。因为浓硫酸加入时,会产生大量热量,在室温下就可使实现衍生反应,因此,衍生反应温度为室温。

(4)衍生时间的选择

取1g样品,加入同样含量的壬二酸标准溶液,加入2mL乙醇,800μL浓硫酸,考察衍生时间为0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min时,衍生物浓度的变化,结果见下表。

表4  衍生时间对衍生反应的影响



可以看出,在0~30min范围内,衍生物浓度基本不变;从30min~60min范围内,衍生物含量略微有些下降。说明反应时间对衍生反应的影响不大,因此,选择衍生时间为10min,衍生反应基本已完成。

(5)提取溶剂的选择

根据衍生物的性质,不溶于水,故在样品提取过程中首先选用实验室常用的正己烷、乙酸乙酯、甲苯和乙腈作为提取溶剂。取1.0试样,加入相同体积的壬二酸标准溶液,加入2mL乙醇,800μL浓硫酸,涡旋混匀,衍生10min,加入相同体积的正己烷、乙酸乙酯、甲苯和乙腈提取衍生物。实验中发现乙腈与衍生溶液完全互溶,因此,剔除乙腈。考察正己烷、乙酸乙酯、甲苯作为提取溶剂的提取效率,实验结果见下表。

表5  提取溶剂对结果的影响



下图为正己烷(蓝色线)、乙酸乙酯(红色线)、甲苯(绿色线)分别作提取溶剂时的叠加色谱图。



图15  不同提取溶剂的色谱图



结合数据表和图,可以看出,正己烷作为提取溶剂提取效果最好,提取液衍生物浓度最大,提取效率最高;实验中发现乙酸乙酯作为提取剂时,提取液不易分层;同时,乙酸乙酯和甲苯作为提取溶剂时,在样品基质中提取液色谱图干扰物质比较多,而正己烷作为提取溶剂时,提取液色谱图干扰小,提取效果好,因此,选择正己烷作为衍生后的提取溶剂。

(6)提取次数的选择

取1g试样,加入2mL乙醇,800μL浓硫酸,涡旋混匀,衍生10min,衍生反应完成后,用正己烷提取衍生物,分别提取1次、提取2次,提取3次,考虑提取次数对衍生结果的影响。实验结果见下表。

表6  提取次数对结果的影响



随着提取次数的增加,衍生液中衍生物的浓度逐渐下降,提取3次和第四次时,衍生液中衍生物的浓度基本不变,因此,提取次数确认为3次。

(3)净化条件选择

用正己烷提取后,因衍生试剂为浓硫酸,正己烷提取液中残留少量的硫酸,有必要对提取液进行净化,以去除残留的硫酸。考虑衍生物和硫酸的性质,考察去离子水、饱和碳酸氢钠水溶液及20g/L的氢氧化钠溶液作为净化溶液,净化结果见下表

                                        表7净化条件对结果的影响

净化溶液选择去离子水1饱饱择洞和碳酸氢钠220g/L氢氧化钠3


衍生物含量mg/L
93.6102.1105.0
93.7102.4102.9
93.7103.194.1
衍生物含量mg/L93.7102.5100.7
标准偏差S0.090.545.80


不同净化试剂净化后色谱图叠加图,如下。



图18  不同净化试剂净化后色谱图



结合表和图可以看出,不同净化试剂净化后,谱图上的差距不大,只有衍生物的含量有

些差距,因此,选择饱和碳酸氢钠作为净化试剂。

通过上述实验,化妆品中壬二酸检测方法总结如下,称取1g(精确至小数点后四位)试样,加入2mL乙醇,加入800μL浓硫酸,涡旋混匀,室温下衍生10min,衍生液加入5mL正己烷,涡旋1min,离心(≥5000r/min)5min,重复提取2次,合并3次提取液,用15mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次,离心(≥5000r/min)5min,取正己烷层,氮吹,约余4.5mL,用正己烷定容至5mL。涡旋混匀,加入少量无水硫酸钠干燥,此为试样液。

方法的性能参数

(1)标准曲线及线性范围

对壬二酸标准溶液进行衍生,得到标准工作溶液的浓度为10~1000mg/L进行测定,以壬二酸衍生物的浓度为横坐标,壬二酸衍生物的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,标准曲线如下图:



图19  壬二酸衍生物标准曲线



从图中可知,壬二酸衍生物壬二酸二乙酯在10mg/L~1000mg/L浓度范围内线性关系良好,R2>0.999。在实际样品测定中,如果样品含量超过线性范围,应当用正己烷将试样液适当

稀释后进样,重新测定。

(2)检出限和定量限

色谱分析的定性检出限定义为响应值为三倍基线噪音时所需的样品量;色谱分析的定量检出限定义为响应值为十倍基线噪音时所需的样品量。壬二酸的加标量均为50mg/kg,在相同条件下测定十次,分别测得十次进样的信噪比,按定性和定量检出限定义,在此分析条件下的检出限数据见下表

二酸二乙酯浓度mg/L10.30810.32610.15810.23010.30010.13510.21810.19810.23310.265
样量g1.02191.07350.97141.02411.03411.00641.01261.10140.99870.9567
容体积mL5555555555
噪比9.810.110.610.29.89.510.499.99.2
3比对应浓度3.1563.0672.8753.0093.1533.2012.9483.3993.2663.142
10倍噪比对应浓度10.51910.2249.58410.03010.51110.6699.82511.33110.88610.474
二酸二乙酯出限mg/kg15.44014.28614.79914.69115.20714.45314.67215.15314.44316.708
二酸二乙酯量限mg/kg51.46847.61949.32948.96950.69048.17648.90650.50948.14455.693


方法检出限为15mg/kg,定量限为50mg/kg



实际样品的检测: 市面上有一些化妆品会被检出。
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衍生试剂与定容试剂都做了试验,选择合适的试剂,数据齐全,试验过程完整。很好的原创。