主题:【第十三届原创】亲水作用色谱(HILIC)(二):可选的固定相有哪些?

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在前一部分中,我们阐述了HILIC的保留机理(亲水作用色谱(HILIC)(一):保留机理知多少),这篇我们将梳理目前市面上可供选择的几大类HILIC固定相。

随着HILIC变得越来越流行,新的HILIC固定相也受到了学术界研究人员和色谱柱厂商越来越多的关注,许多新的固定相在最近几十年也逐渐商业化,同时也有不断有新的固定相被尝试用于HILIC模式,包括前面的文章中提到的混合模式(mixed-mode)色谱(大极性化合物分析的新思路——深入剖析混合模式色谱(Mixed-Mode Chromatography))在某些流动相条件下也包含了HILIC模式。

在这里需要说明的是,HILIC只是一种色谱模式,虽然有些厂家会把某些色谱柱命名为HILIC柱,但它们只有在一定的流动相条件下才发挥HILIC的作用。正如第一部分的机理所言,HILIC固定相表面都有一个“富水层”,因此流动相里都必须含有一定的水(各固定相有差异,一般要求>3%),或者含有一定的极性溶剂(如甲醇,但严格意义上不属于HILIC模式),但一般水相比例也不宜过高(一般不高于60%)。另外,由于HILIC固定相极性都比较大,一般都可以作为正相固定相使用,也就是说很多情况下HILIC固定相和正相固定相是相通的。HILIC固定相的分类方法有很多,比如按照电性可以分为中性,阴离子型,阳离子型和两性离子型等。为了便于大家更全面了解常见的HILIC固定相,本文将参考文献中的分类方法,按照键合相的性质将HILIC固定相分为五大类,并简单介绍其特点并分析其可以提供的作用力,方便大家更精准地根据具体分析物性质来选择合适的色谱柱。

下面将主要介绍五大类HILIC固定相:

1. 硅胶(silica gel)

未修饰的裸硅胶是最常见的HILIC固定相,但是商业化的硅胶材料由于制备技术的差异会在纯度上有差别。现在主要有ABC三种硅胶:A类硅胶通过硅酸盐在溶液中沉淀而制得,它由于含有一定量的金属离子活化了硅醇基团而呈酸性,这也造成了过强保留和/或峰不对称的问题;B类硅胶纯度很高,金属离子含量很低,酸性较弱,它在中等和更高的pH条件下有较好的稳定性,它一般提供比A类硅胶更好的分离效果,特别是对于碱性样品;C类硅胶具有硅氢化表面,也就是表面主要是Si-H而不是Si-OH,这样最多可以减少95%的硅羟基,因此C类硅胶比拥有更大量硅醇基团的A类和B类硅胶极性小,同时由于其对水的吸附更少,因此比其他类型的硅胶的保留重现性更好。裸硅胶可以用于在HILIC模式下分离酸性或碱性化合物



图1 A,B,C类硅胶示意图


裸硅胶由于没有其他键合的基团,因此不存在键合相的流失,所以非常适合于应用于HILIC-MS。但是,随着分析化合物的多样性,很多键合的不同基团的硅胶固定相被发展和使用,也广泛地用于HILIC-MS。


可提供的主要作用力:阳离子交换,阴离子排斥、氢键作用等。


2. 化学键合相(Chemically bonded phases)

这类固定相比较多,包括氨基(amino)二羟基(diol)氰基(cyano)酰胺(amide)和其他键合相。它们往往通过对硅胶或者聚合物表面进行化学修饰而制备得到。

氨丙基键合硅胶是第一个广泛用于在HILIC模式下分离碳水化合物的键合固定相,也特别适合在HILIC模式下分离酸性化合物。氨丙基键合硅胶存在一些严重的缺点,那就是在某些缓冲液条件下平衡非常慢,同时在含水流动相条件下不够稳定,相对容易发生键合相的流失从而伴随出现峰形变差、保留时间无法重现等问题,另外氨基也可能与某些化合物(如羰基类化合物)发生反应(席夫碱反应)而影响出峰


现在也有厂家改进了氨基柱的键合设计,通过在氨基和Si之间加入一个linker(如图2右所示),这样就可以在利用氨基的独特选择性的同时增加了键合相在含水流动相中的稳定性。


图2 氨丙基键合相和改进的氨基键合相示意图



可提供的主要作用力:阴离子交换,阳离子排斥,氢键作用等。

二羟基(diol)键合硅胶在总体极性方面最接近于裸硅胶。它具有非常大的极性,同时可以提供很强的氢键作用,是一类非常理想的HILIC固定相,被各大厂商生产。

图3 二羟基键合相示意图



除了二羟基,有些厂商也推出类似的多羟基或者聚二羟基固定相,它们的亲水能力有一定的差异,但是提供的作用力类型差不多。

可提供的主要作用力:氢键作用等。

氰丙基(cyano)键合硅胶也是被很多人熟知的一类固定相,特别是作为正相固定相。但是由于其缺少氢键作用能力,因此在含水有机相中对极性化合物的保留很弱,所以在最近这些年,把它作为HILIC固定相来使用的情况逐渐消失





图4 氰基键合相示意图



可提供的主要作用力:偶极-偶极作用,π-π作用等。


酰胺(amide)键合硅胶也被广泛用于HILIC分离。由于酰胺基不带碱性,因此这类柱子的保留能力对流动相pH不如氨基键合硅胶敏感,但是塞翁失马,由于其不具有一级胺,因此可以防止与还原性糖和其他羰基化合物形成席夫碱(Schiff's base)而造成的峰形和使用寿命的问题。


图5 酰胺键合相示意图


可提供的主要作用力:氢键,偶极-偶极作用等。


3. 离子交换和两性离子固定相(Ion exchange and zwitterionic stationary phase)

表面被轻度磺化的苯乙烯-二乙烯基苯基质的阳离子和阴离子交换材料已经用于分离非离子极性化合物,如一些糖类。它们的HILIC/离子交换混合作用机理控制着分析物的保留,也可能形成独特的选择性。


图6 一种阳离子交换(磺酸基)键合相示意图


磺化烷基甜菜碱这种两性离子也被设计成HILIC固定相,特别是分离无机盐、小分子有机离子化合物和蛋白。它们一般是通过在大孔径硅胶或者聚合物基质上连接活性聚合物层而制得,这些聚合物同时包含由短的烷基链分隔开的强酸性的磺酸基团和强碱性的季铵基团(如图7所示)。它们在HILIC固定相中有独特的地位,因为其键合层只具有非常低的净负电荷,只很小程度地受到pH的影响。因此,两性离子的离子交换作用比离子交换和键合的氨基固定相小很多。另外,研究表明其静电作用也比裸硅胶、酰胺和其他键合固定相小,这是因为残留硅醇被自我结合的相反电荷的官能团所屏蔽。磺化烷基甜菜碱可以有很强的表面吸附水的能力,其表面的“富水层”很稳定,可以被当做形成了液态水层。


图7 两性离子键合相示意图


这类离子交换和两性离子固定相是现在色谱前沿的研究热点,除了图6和图7所示的两种离子键合相外,不断有新的固定相被发展出来和商业化,以解决更具挑战性的色谱分析难题。


可提供的主要作用力:离子交换,氢键,偶极-偶极作用,疏水作用等。

4. 亲水大分子键合相(Hydrophilic macromolecules bonded phases)


一些大分子,比如环糊精(CDs)和环果聚糖(CFs)也已经被应用于制备HILIC固定相。这些大分子含有多重极性基团,因此可以提供很好的亲水性。


图8 环糊精(CDs)和环果聚糖(CFs)键合相示意图

环糊精包括六元、七元和八元环,由于其独特的拓扑结构和疏水性空腔,它们也被用来作为在正相或者反相条件下的手性固定相。同时,由于分子外侧多羟基的存在,环糊精或其衍生的结构也被用于作为HILIC固定相来分离极性分析物。


环果聚糖(CFs)是由六个或者更多的β-(2-1)连接的呋喃果糖单元构成。在CFs中,CF6由于其高度规整的几何构型以及纯净形式的易得性而备受关注。天然的或者衍生的CF6键合硅胶材料被用于制成HILIC固定相。它们被成功用于分离核苷酸和多肽。


可提供的主要作用力:氢键,疏水作用等。


5. 表面离子液体键合相(Surface-confined ionic liquids stationary phases)

基于离子液体(IL)的固定相也被用于HILIC模式。由于它们自身的特性,特别是它们的高亲水性,离子液体似乎特别适合这个领域。离子液体一般通过共价键或者阴阳离子聚合的方法固定在基质表面。很多离子液体固定相看上去在HILIC应用中很有前途,特别是分离酚酸和类黄酮。


图9 两种离子液体键合相示意图






可提供的主要作用力:氢键,阴离子交换、阳离子排斥等。

总结

HILIC固定相可以说是百花齐放,可供色谱分析研究者选择的种类非常多。本文参考文献中的分类方法,按照键合相的性质将HILIC固定相分为五大类(我们通过全面调研市面上各家的HILIC固定相,确定基本都可以归为这几大类),介绍各自的特点并分析其可以提供的作用力,希望可以拓展大家在HILIC方法开发时的选择空间,同时帮助大家更精准地选择色谱柱。在接下来的部分,我们将介绍HILIC中保留和选择性的控制。



参考文献
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本文首发于微信公众号:爱色谱。




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