主题:超高效液相色谱—串联质谱法测定中药材山药中30种农药残留

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超高效液相色谱—串联质谱法测定中药材山药中30种农药残留

  张彩凤   

(浙江捷岛检测科技有限公司,浙江 杭州 310030)


摘 要:建立了中药材山药中30种农药的超高效液相-串联质谱检测方法。 样品中的农药残留化合物经乙腈提取,BRP固相萃取柱净化,采用 A:缓冲液(0.1 %甲酸溶液含5 mmol/L甲酸铵),B:乙腈-缓冲液(95:5)作为流动相进行梯度洗脱,多反应监测模式(MRM),分段时间窗口采集。30种禁用农药在2.5的线性范围内,线性良好,相关系数在0.9974~1.0000之间。在0.06、0.10、0.12 3个添加浓度水平进行了回收率试验,平均回收率61 %~108 %,相对标准偏差在0.24 %~8.11%(n=6)之间,各农药成分的检出限在0.11~5之间。该方法操作简单,灵敏度、准确度和精密度均符合多农残检测技术的要求,可为中药材中农残风险评估研究提供准确有效的数据支持。
关键词:超高效液相色谱—串联质谱;山药; 农药残留
Detection of 30 pesticides residues in traditional Chinese medicine Dioscorea opposita by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric

Zhang Caifeng 

(Zhejiang Jiedao detection technology co., Ltd, Hangzhou city, Zhejiang Province, China 310030)


Abstract:  An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was developed for the determination of thirty pesticides in traditional Chinese medicine Dioscorea opposita; The pesticides were extracted with acetonitrile,cleaned up by BRP solid phase extraction column; Gradient elution was carried out using A:Buffer (0.1% formic acid solution containing 5 mmol/L ammonium formate) and B: acetonitrile - Buffer (95:5) as mobile phases, and Multiple reaction monitoring(MRM) model was used, The data of the detector was collected by time windows. The recoveries at 3 spiked levels 0.06 mg▪kg-1、0.10 mg▪kg-1 and 0.12 mg▪kg- 1 of 30 target compounds were ranged from 61% to 108%, with the relative standard debiations(RSD) from 0.11% to 8.11% (n=6), and the detection limit were ranged from 0.11μg ▪ kg-1  to 5.0μg ▪ kg-1  (S/N=3). This simple , sensitive and accurate method can be applied to supplying reliable data for the study of the risk assessment of traditional Chinese medicine.
Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric ;  Dioscorea opposita ;  pesticide residues
山药(Dioscorea opposita),别名怀山药、淮山药、土薯、山薯、玉延等,主要产于中国华北、西北及长江流域的江西、湖南等地。山药味甘性平,归脾、肺、肾经,具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精等功效,现代药理学研究表明,其具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤、降血糖等作用【1】。为患者或体弱者服用,随着人们对药品安全性要求不断提高,农药残留问题成为人们关注的焦点,由于某些农药具有残留周期长、污染范围广等特点,为保护消费者的健康,建立高灵敏度、高选择性的多农残检测方法,是农药残留检测技术的发展趋势【2】。对“绿色中药材”的生产具有重要意义【3】。
农残检测的方法有:薄层色谱法【4】、气相色谱法【5-7】、液相色谱法【8-9】,气质联用法【10-13】、液质联用法【13-18】、免疫分析法【18-19】等。本文通过色谱条件的优化选择,建立了山药中30种农药残留的超高效液相色谱-串联质谱检测法。该方法操作简单、经济实用,灵敏度、准确度和精密度均符合多农残检测技术的要求,可为中药材中农残风险评估研究提供准确有效的数据支持。
1 实验部分
1.1 主要仪器和设备
超高效液相色谱仪:Acquity  UHPLC,含四元梯度泵、样品管理器、柱温箱 ,美国沃特世公司;串联质谱:API 4000 ,美国AB 公司;化学工作站:Analyst,美国AB SCIEX ;分析柱:  Acquity UPLC  BEH C18 2.1 mm*100 mm ,1.7μm 美国沃特世公司;离心机: TDL-40B  ,上海安亭科学仪器厂;氮吹仪: MTN-2800W ,天津奥特赛恩斯仪器有限公司 ;固相萃取仪:ASE-12,  天津奥特赛恩斯仪器有限公司 ;漩涡混合器: XW-80A    上海沪西分析仪器厂有限公司;固相萃取柱:Welchrom BRP 200 mg/6 mL,月旭科技(上海)股份有限公司;电子分析天平:感量0.1mg,上海舜宇恒平科学仪器有限公司; 移液枪:(100-1000)μL、(20-200)μL 、(5-50)μL,美国赛默飞科技(中国)有限公司  ; 微孔滤膜:尼龙 0.22μm ,岛津GL(上海)商贸有限公司
1.2 试剂
30种农药混合标液: 100μg ▪ mL-1(乙腈);上海安谱科学仪器有限公司;乙腈:HPLC级 ,美国天地公司;甲酸:分析纯, 阿拉丁试剂上海有限公司;甲酸铵:分析纯 阿拉丁试剂上海有限公司;超纯水: Milli-Q Element A10  , 德国默克;山药粉:安徽一中药饮片厂
1.3 标准溶液的制备
混合禁用农药标准储备液(1.0 μg ▪ mL-1):移取100 μL浓度为100μg ▪ mL-1的农药混合标液,用乙腈定容至10 mL,摇匀,备用;
混合农药标准储备液(100 ng ▪ mL-1):移取1.0 mL浓度为1.0μg ▪ mL-1的混合禁用农药标准储备液,用乙腈定容至10 mL,摇匀,备用。
基质混合标液的制备:分别精密移取空白基质溶液1.0 mL(7份),置氮吹仪上,40 ℃水浴浓缩至近干,分别精密移取一定体积的1.0 μg ▪ mL-1、100 ng ▪ mL-1的混合禁用农药标准储备液,用乙腈-水溶液(1:1)稀释到1mL,微孔滤膜过滤后待上机。所配系列标准溶液浓度见表1。

表1  30种混合禁用农药标液浓度表

(单位 ng ▪ mL-1)

农 药空白基质浓度1浓度2浓度3浓度4浓度5浓度6

30种

0

2.5

5

10

25

50

75


1.4 空白基质溶液的制备
  取空白基质样品,同供试品溶液的制备方法处理成空白基质溶液。
1.5 样品的提取和净化
1.5.1 样品提取
取供试品粉末(过三号筛)5g,精确到0.1 mg,加氯化钠 1g,精确到1mg,立即摇散,再加入50mL乙腈,震荡、漩涡混合2 min,离心5min,收集上清液,沉淀中再加入50 mL乙腈,震荡、漩涡混合2 min,离心5min,合并上清液,40℃氮吹浓缩至近干,用乙腈溶液稀释至10mL。摇匀,待净化。
1.5.2 样品净化
移取1.5.1 提取的样品溶液3mL,通过BRP固相萃取柱净化,收集全部滤液,混匀,精密移取1.0 mL,置氮吹仪上,40℃水浴浓缩至近干,用乙腈—水溶液(1:1)稀释到1mL,微孔滤膜过滤后待上机。
1.6 分析条件
1.6.1 液相条件
流动相A: 缓冲盐(0.1%甲酸溶液含5mmol/L甲酸铵),流动相B: 乙腈-缓冲盐(95:5),洗脱方式见 表2
流  速:0.20 mL/min
进样量:10μL
表2  流动相梯度洗脱

时间(min)

A (%)

B (%)

0-0.5

70

30

9 -11

10

90

11.01-14

70

30


1.6.2 质谱条件
离子源: 电喷雾离子源(ESI),正离子扫描模式 ;
监测模式:多反应监测(Schudled  MRM);
喷雾电压:5500 V;脱溶剂温度:550 ℃
气帘气:10 psi ;碰撞气:6
辅助气(GAS1、GAS2): 55 psi
化合物保留时间、监测离子对、碰撞电压等参数见表3

表3    30种农药质谱参数


化合物 

离子对

(m/z)

保留时间(min)

DP

(V)

CE

(V)

化合物 

离子对

(m/z)

保留时间(min)

DP

(V)

CE

(V)

甲胺磷

142.1 > 94.0 *

1.21

65

20

胺苯磺隆

411.0 > 196.1 *

4.51

80

22

142.1 > 125.1

1.21

65

18

411.0 > 168.1

4.51

80

40

涕灭威亚砜

207.2 > 89.0 *

1.24

65

17

甲拌磷亚砜

277.1 > 199.0 *

4.63

65

15

207.2 > 132.1

1.24

65

10

277.1 > 171.0

4.63

65

19

久效磷

224.2 > 193.1 *

1.39

65

11

内吸磷

259.1 >  89。0 *

5.43

52

11

224.2 > 127.1

1.39

65

22

259.1 >61.1

5.43

52

45

涕灭威砜

223.2 > 76.0 *

1.54

75

12

特丁硫磷亚砜

305.3 > 187.1 *

5.72

65

16

223.2 > 86.1

1.54

75

22

305.3 > 97.0

5.72

65

50

240.2 > 223.1 *

1.54

40

11

甲拌磷砜

293.1 > 171.1 *

5.83

70

16

240.2 > 86.2

1.54

40

25

293.1> 247.0

5.83

70

10

杀虫脒

197.2> 117.1 *

1.98

120

40

水胺硫磷

312.2 > 270.0 *

5.87

70

20

197.2 > 46.1

1.98

120

43

312.2 > 236.1

5.87

70

22

3-羟基克百威

238.1> 181.0 *

2.18

75

17

苯线磷

304.3 > 217.2 *

6.45

100

31

238.1 > 163.2

2.18

75

18

304.3 > 234.1

6.45

100

25

硫环磷

256.1 > 140.0 *

2.84

85

35

灭线磷

243.2 > 131.0 *

6.75

70

30

  256.1 > 168.1

2.84

85

22

243.2 > 97.0

6.75

70

40

苯线磷亚砜

320.3 > 171.1 *

3.11

110

31

特丁硫磷砜

321.2 > 171.0 *

6.77

75

16

320.3 > 292.1

3.11

110

21

321.2 > 96.9

6.77

75

50

磷胺

300.2 > 174.1 *

3.32

80

20

氯唑磷

314.2 > 162.1 *

7.63

80

22

300.2 > 127.1

3.32

80

25

314.2 > 120.1

7.63

80

35

涕灭威

213.2 > 89.0 *

3.4

30

24

蝇毒磷

363.2 > 227.0 *

8.22

100

35

213.2 > 116.0

3.4

30

16

363.2 > 307.0

8.22

100

25

208.2 > 89.0 *

3.4

30

24

甲基异柳磷

332.2 > 273.1 *

8.27

50

8

208.2 > 116.0

3.4

30

16

332.2 > 231.0

8.27

50

17

甲磺隆

382.1> 167.2 *

3.95

100

25

硫线磷

271.1 > 159.0 *

8.28

65

19

382.1 > 199.1

3.95

100

30

271.1 > 131.1

8.28

65

31

苯线磷砜

336.2 > 188.2 *

4.04

100

37

地虫硫磷

247.1 > 137.1 *

8.44

60

15

336.2 > 266.1

4.04

100

30

247.1 > 109.1

8.44

60

25

氯磺隆

358.2 > 167.1 *

4.27

120

25

治螟磷

323.2 > 171.2 *

8.5

77

18

358.2 > 141.2

4.27

120

25

323.2 > 115.0

8.5

77

40

克百威

222.2 > 165.2 *

4.36

70

18

甲拌磷

261.2 > 75.0 *

8.6

45

16

222.2 > 123.0

4.36

70

30

261.2 > 47.1

8.6

50

45



注:标注“*”为定量离子
2  结果与讨论
2.1 液相条件的建立
实验考察了流动相中缓冲盐浓度、梯度条件、流速对30种农药分析效果的影响。不同比例的缓冲盐浓度、梯度条件和流速,对各组分的响应值、分离度、保留时间以及峰型都有很大影响,随着缓冲盐浓度增加,各组分的响应值增加,当甲酸和甲酸铵浓度高于1.6中条件时,各组分的响应值无明显增加;随着流动相比例增加,各组分保留时间缩短分离度下降,部分组分响应值降低,当有机相比列降低,保留时间加长,峰型变宽,灵敏度下降;当增大流速时,出峰太快,组分分离度下降,当降低流速时,保留时间加长,峰宽变宽,灵敏度下降。
综合各因素考虑,流动相及梯度为1.6中条件时,30组分的灵敏度及分析效果最佳。
2.2 质谱条件的选择
  实验考查了GAS1、GAS2、气帘气、碰撞气、DP电压、CE电压等参数对各物质响应值的影响,实验表明,1.6中的质谱参数化合物能够获得更高的响应值;为了消除复杂基质对检测灵敏度的影响,采用Schudled  MRM监测方式,减少基质的干扰,大大提高了各待测组分的灵敏度和定量的准确性。30种禁用农残的加标图谱见图1、多反应监测色谱图见表4

图1  0.06 mg·kg-1 山药加标图谱

表4  多反应监测色谱图

化合物

离子对 (m/z)

色谱图

离子对 (m/z)

色谱图

化合物

离子对 (m/z)

色谱图

离子对 (m/z)

色谱图

甲胺磷

142.1 > 94.0 *

142.1 > 125.1

胺苯磺隆

411.0 > 196.1 *

411.0 > 168.1

涕灭威亚砜

207.2 > 89.0 *

207.2 > 132.1

甲拌磷亚砜

277.1 > 199.0 *

277.1 > 171.0

久效磷

224.2 > 193.1 *

224.2 > 127.1

内吸磷

259.1 > 89.0 *

259.1 > 61.1

涕灭威砜

223.2 > 76.0 *

223.2 > 86.1

特丁硫磷亚砜

305.3 > 187.1 *

305.3 > 97.0

240.2 > 223.1 *

240.2 > 86.2

甲拌磷砜

293.1 > 171.1 *

293.1> 247.0

杀虫脒

197.2> 117.1 *

197.2 > 46.1

水胺硫磷

312.2 > 270.0 *

312.2 > 236.1

3-羟基克百威

238.1> 181.0 *

238.1 > 163.2

苯线磷

304.3 > 217.2 *

304.3 > 234.1

硫环磷

256.1 > 140.0 *

  256.1 > 168.1

灭线磷

243.2 > 131.0 *

243.2 > 97.0

苯线磷亚砜

320.3 > 171.1 *

320.3 > 292.1

特丁硫磷砜

321.2 > 171.0 *

321.2 > 96.9

磷胺

300.2 > 174.1 *

300.2 > 127.1

氯唑磷

314.2 > 162.1 *

314.2 > 120.1

涕灭威

213.2 > 89.0 *

213.2 > 116.0

蝇毒磷

363.2 > 227.0 *

363.2 > 307.0

208.2 > 89.0 *

208.2 > 116.0

甲基异柳磷

332.2 > 273.1 *

332.2 > 231.0

甲磺隆

382.1> 167.2 *

382.1 > 199.1

硫线磷

271.1 > 159.0 *

271.1 > 131.1

苯线磷砜

336.2 > 188.2 *

336.2 > 266.1

地虫硫磷

247.1 > 137.1 *

247.1 > 109.1

氯磺隆

358.2 > 167.1 *

358.2 > 141.2

治螟磷

323.2 > 171.2 *

323.2 > 115.0

克百威

222.2 > 165.2 *

222.2 > 123.0

甲拌磷

261.2 > 75.0 *

261.2 > 47.1


2.3 线性方程和检出限
在1.6分析条件下,对基质混合标液进行测定,对各化合物的质量浓度x(ng·mL-1)和定量离子的丰度y(counts)进行线性回归,用3倍噪声(S/N=3)对应的溶液浓度表示待测组分的方法检出限,30种农药的线性回归方程、相关系数及检出限见表5。
    表5  线性回归方程及检出限

化合物

线性回归方程

相关系数(r)

检出限        (μg ▪ kg-1

甲胺磷

y = 1.11e+003 x + -279

0.9996

5.00

涕灭威亚砜

y = 1.79e+003 x + 9.58e+003

0.9990

2.00

久效磷

y = 1.43e+004 x + -1.29e+003

0.9999

1.00

涕灭威砜

y = 2.3e+003 x + -2.11e+003

0.9993

4.00

y = 2.32e+004 x + 5.87e+004

0.9982

5.00

杀虫脒

y = 2.03e+003 x + -694

0.9997

5.00

3-羟基克百威

y = 4.63e+003 x + -836

0.9998

2.50

硫环磷

y = 1.98e+004 x + -2.12e+003

1.0000

0.42

苯线磷亚砜

y = 1.04e+004 x + -5.92e+003

0.9998

0.87

磷胺

y = 2.73e+004 x + 2.09e+003

0.9999

0.56

涕灭威

y = 282 x + -65.4

0.9983

5.00

y = 1.44e+003 x + -544

0.9983

2.00

甲磺隆

y = 6.92e+003 x + -3.3e+003

0.9990

0.77

苯线磷砜

y = 8.26e+003 x + -4.59e+003

0.9998

0.77

氯磺隆

y = 226 x + -253

0.9980

5.00

克百威

y = 2.36e+004 x + -2.32e+003

0.9999

0.77

胺苯磺隆

y = 3.02e+004 x + -1.35e+004

0.9995

0.54

甲拌磷亚砜

y = 2.43e+004 x + 1.73e+003

0.9999

0.44

    

内吸磷

y = 310 x + -359

0.9986

4.00

特丁硫磷亚砜

y = 3.62e+004 x + 1.21e+004

0.9995

0.18

甲拌磷砜

y = 5.9e+003 x + 3.28e+003

0.9996

1.67

水胺硫磷

y = 949 x + 175

0.9998

1.67

苯线磷

y = 4.36e+004 x + 3.01e+003

0.9997

0.45

灭线磷

y = 1.78e+004 x + -112

0.9996

1.33

特丁硫磷砜

y = 8.04e+003 x + -2.23e+003

0.9992

0.91

氯唑磷

y = 5.27e+004 x + -1.13e+004

0.9998

0.11

蝇毒磷

y = 1.58e+004 x + -69.3

0.9996

0.49

甲基异柳磷

y = 4.93e+003 x + 2.57e+003

0.9974

0.61

硫线磷

y = 7.77e+004 x + 1.16e+004

0.9998

0.80

地虫硫磷

y = 1.23e+004 x + -4.32e+003

0.9997

1.00

治螟磷

y = 2.39e+004 x + -5.06e+003

0.9995

0.23

甲拌磷

y = 4.98e+003 x + -2.9e+003

0.9997

2.00


2.4 精密度与加标回收试验
按1.5方法对添加一定量30种混合农残标液的山药样品进行处理后,在1.6条件下测定,每个添加水平完成6次平行测定,进行加标回收试验,结果见表6。由表6可知,禁用农残的添加水平在0.06 mg▪kg-1、0.10 mg▪kg-1、0.12 mg▪kg-1时,平均回收率在61 %-108 %之间,相对标准偏差在0.24 %-8.11%(n=6),试验表明除了甲胺磷在低添加水平时回收率偏低外,其他29种农药的回收率及精密度均满足残留的分析要求。
2.5 样品测定
  利用本研究对3个山药样品进行检测,30种农药均未检出。

表6 
3结束语
建立了超高效液相-串联质谱法同时测定30种农残的检测方法,该方法前处理简单,分析时间短,专属性强,回收率良好,为中药饮片风险评估研究提供准确有效的数据支持。
            参 考 文 献
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