主题:【原创】活体光学成像技术专栏| 活体成像中荧光蛋白的挑选指南

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瑞沃德
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引言

无数科学家的努力下,蛰居在水母的绿色荧光蛋白已经被导入到病毒、放线菌、酵母、植物、果蝇、线虫、小鼠、大鼠、人类细胞等几乎所有的模式生物,荧光蛋白的发现与应用被认为是点亮了生命科学,让黑暗中的生命活动被可视化的展示在科学家眼前。

上期文章中,我们对比了活体光学成像的两种技术,生物发光和荧光成像的不同点。随着荧光标记技术的进一步发展,荧光成像的应用范围已经大大超过了生物发光,荧光成像已经可以满足绝大多数情况下的实验需求。

荧光成像需要对检测的细胞或分子进行荧光标记。目前,主要有两种标记方法,第一种利用内源荧光信号,在细胞中表达荧光蛋白进行标记。第二种利用荧光分子对细胞、药物或纳米颗粒等分子进行标记。本期将为大家介绍荧光蛋白选择方法!

Rainbow of fluorescent proteins [Tsien lab]

选择荧光蛋白建议考虑的参数



1. 激发波长/发射波长:每一种荧光蛋白都有其独特的激发波长和发射波长,因此,选择的荧光蛋白必须是使用的成像系统能够激发和检测到的。比如,使用的成像系统只有两个激发光源:488 nm561 nm那就不能够选择远红外荧光蛋白。同时使用超过一个荧光蛋白时,必须确保发射波长没有重叠。荧光蛋白应用于活体成像实验时,尽量选择红色或近红外的荧光蛋白,这类荧光蛋白的发射波长较长,具有更好的组织穿透能力。

2. 寡聚反应早期开发的荧光蛋白易于寡聚化,目的基因融合表达时可能会影响目的基因蛋白的生物学功能。因此建议使用单体的荧光蛋白,比如mCherry

3. 亮度:荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下,将荧光蛋白的亮度与EGFP(设定为1)进行比较,有一些荧光蛋白非常暗淡(例如TagRFP657,其具有亮度只有0.1因此活体成像实验时,亮度也需要考虑。

4. pH稳定性:如果计划在酸性环境中表达荧光蛋白,则此参数非常重要,一些荧光蛋白具有不同的激发/发射光谱(例如mKeima)或在pH变化时荧光强度会发生改变(例如pHluorinpHTomato)。

5.避免自发荧光:生物体自身的很多物质具有较强的自发荧光,如指甲、毛发具有强烈的绿色背景信号,因此活体成像时需要对动物进行完全的脱毛处理或尽量避免绿色荧光蛋白,可选RFPdsRed, mCherry, mTomato等荧光蛋白。

在选择好了荧光蛋白后,后续就是做实验、拿数据、发文章了!是选用什么成像设备好呢?点击了解更多详情!
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