主题:【第十三届原创】三个实验方法来看内标法的应用

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三个实验方法来看内标法的应用

稳定同位素氘代、13C、15N标记物作为质谱分析中的内标使用,已经广泛应用于食品检测、环境监测,尤其对于食品检测,基质效应是不可避免的问题,基质匹配曲线越来越被诟病,内标法仿佛成为解决基质效应唯一的办法,近几年越来越多的检测方法逐步开发改进为内标法,内标法便利准确,灵活可变,不必担心提取液是否取完,不必担心过柱损失和洗脱不完全,不必担心定容体积,甚至操作失误都无所谓,但相对于外标法的理解和运算多了几道弯,不同的人思维角度不同,不去认真思考,不仅不能完全发挥出内标法的灵活多变、肆意发挥的优势,而且有可能走入误区,得出错误的运算结果,其实是需要对内标法实验进行认真梳理思考的。我结合最近的三个不同设计思路内标实验,把自己对内标法的理解总结一下,分享给有需要的人,希望对对初学者有所帮助,不对地方也请多多指正。

实际工作中,一般要求样品和标准里内标加入量要一致,方便计算,内标法横坐标是mr,纵坐标是Ar/(As/ms),是通过线性方程以及坐标图,根据根据样品里的Ar/(As/ms),计算含量,

(其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高,ms和mr分别为加入内标物和待测物的量)

横坐标是mr,可以输入浓度,也可以是绝对量,一般要样品和标准保持一致。

首先是实验1,

标准配置:分别吸取25.0ng/mL甲硝唑应用液0.02mL、0.04mL、0.1mL、0.2mL,20.0ng/mL D4-甲硝唑应用液各100μL,10%甲醇/水溶液定容至1.0mL,制备成甲硝唑含量0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL,供测定用, LC-MS/MS分析后绘制标准曲线。

4.1样品提取:样品提取:称取蜂蜜 5g(精确至 0.01g)于 50mL 离心管中,分别加入 100μL 20ng/mLD4-甲硝唑应用液,加水 10mL,混匀溶解,再加入 10mL 乙酸乙酯,涡旋提取 2min,1000rpm 离心 2min,吸取上层乙酸乙酯相 5mL 入 10mL 试管,50℃氮气吹干后,加入 0.1mL 甲醇溶解,再加入 1.9mL 40mmol/L 盐酸溶液,超声溶解 1min,转入 2mL 离心管,12000rpm 离心 2min,上清液待净化。

4.2 样品净化:依次用 5mL 甲醇、5mL 水、5mL 40mmol/L 的盐酸溶液活化平衡  SCX 固相萃取柱,然后转移上述上清液至 SCX 柱内,待样品过柱后,用 5mL 水淋洗除杂,真空抽干柱内液体后,用 5mL 甲醇淋洗除杂,真空抽干后用 5mL 5%氨化甲醇 洗脱,收集于 10mL 具塞试管内,洗脱液50℃下用氮气吹干,分别先加入 0.1mL 甲醇超声溶解残留物,再加入 0.9mL 10%甲醇/水溶液混 匀,过 0.22μm 滤膜后待 LC-MS/MS 分析。

实验1,样品从称样加入100μL 20ng/mL的内标溶液,最终定容体积是1mL,是全过程内标校准,标准中加入了100μL 20ng/mL的内标溶液,定容至1.0mL,标准曲线为浓度表示,即样品曲线含量mr为浓度ng/mL,最终结果(mr*1ml)/5g单位ug/kg。

这种设计思路是保持上机阶段,样品内标浓度和标准系列中内标浓度一致,举例:如果样品内标加入量为标准曲线的一半量(50ul)的话,(比如发现内标不够用的时候),相应的样品定容体积可以更改为0.5ml,如果必须定容到1ml的话,相应运算结果要除以2去校正内标的不一致。

这种内标设计重点掌握保持上机样品内标浓度和标准系列中内标浓度一致。

可以变换的地方有,提取液加入的体积,文中红色字体部分,可根据需要调整,不必考虑运算,最后定容一般不改,如果要改变定容体积,需要校正计算



实验2,

丙烯酰胺标准系列溶液:分别准确吸取丙烯酰胺标准使用液(1ppm), 0.01、 0.02、0.05、0.1、0.2 和 0.5 mL 于 6 个 2 mL 容量瓶中,再准确吸取丙烯酰胺- 13C 使用液(1ppm)0.1 mL 于以上 6 个容量瓶中,加水定容。即标准系列溶液中分 别含丙烯酰胺 10、20、50、100、200 和 500 ng,含丙烯酰胺- 13C 100 ng。标准系列溶液临用现配。

5.2 试样处理

准确称取样品 2 g(精确至 0.01 g),于 50 mL离心管中,加入丙烯酰胺- 13C 使用液(1ppm)0.1mL,静置后加入 9mL 水并振摇或涡旋使试样分散,再加 入 10 mL 乙腈,5mL 正己烷,涡旋 1min。然后,加入 1.5 g 无水醋酸钠和 6 g无水硫酸镁,置于摇床振摇 1h。在 4℃下,以 10000 r/min 离心 8 min,弃去上层 正己烷层,取乙腈层 3mL 过 MCX 固相萃取柱,直接收集上柱的乙腈溶液,在 氮气下吹干,用 0.3 mL 水溶解残渣,过有机微孔滤膜后,待测定。

实验2样品从称样加入了100 ng内标,样品的最终定容体积是0.3ml,也是全过程校准;

标准系列也是加入了100 ng内标,标准的定容体积是2ml,标准曲线横坐标输入的绝对量,

结果计算就是曲线含量mr(ng)除以取样量2g,最终结果mr*/2g单位ug/kg。

种设计思路是保持内标的绝对量一致,样品和标准上机的内标浓度水平并不一致),因为是用绝对量计算,所以这里标准和样品的定容体积都可以随便更改(响应合理范围内),比如,感觉0.3ml体积太小,不容易过膜,更改为0.5ml,定容体积不参与运算,不同的定容体积的样品可以一起进样计算。

实验2其实就是标准的内标法定义的“加入一定重量的...”,按绝对量一致设计的,计算更为简单,灵活多变,只是有时候大家习惯用浓度表示横坐标,习惯定容体积参与运算,才有了实验1的设计。

可以发挥更改的地方红色字体部分,不必考虑运算。


实验3,

标准系列:分别准确移取 20 μL 同位素内标混合溶液于各内插管中,加入 180 μL 对应 的混合标准曲线浓度点溶液,于涡旋混合器上混合均匀,配制成混合标准曲线溶液系列

5.2 样品提取及净化

准确称取 5 g(精确到 0.01 g)试样于 50 mL 离心管中,加入 20 mL 乙腈 水-甲酸(70+29+1,体积比)溶液,并用涡旋混合器混匀 1 min,置于旋转摇床上 振荡提取 30 min,取 1.0 mL 提取液至 1.5 mL 离心管中,以 10000 转/分钟 离心 5 min。准确转移 0.5 mL 上清液于另一 1.5 mL 离心管中,加入 1.0 mL 水,旋涡 混匀后,在 4℃下以 10000 转/分的转速离心 5 min,吸取上清液过 0.22 μm 滤膜。 吸取 180 μL 处理好的样品滤液于 300 μL 内插管中,加入 20 μL 同位素混合内标 溶液,涡旋混匀,待进样。

实验3是上机前加入内标,只负责基质校准,这种也是保持上机浓度一致,横坐标也是浓度,结果计算为:(mr*1.5ml/0.5ml)*20ml/5g单位ug/kg,因为是上机前加入,所以并不校准提取过程,所以前处理的加入的提取液体积和稀释倍数,都要参与计算。更改后要记得相应调整运算。


最后把内标法定义的一些个人理解总结如下

内标法的定义,内标法(Internal Standard Method)是将一定重量的纯物质作为内标物,加到一定量的被分析样品混合物中,然后对含有内标物的样品进行色谱分析,测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)及相对校正因子,按公式即可求出被测组分在样品中的百分含量。f=(As/ms)/(Ar/mr)

其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高,ms和mr分别为加入内标物和待测物的量。

As/ms和Ar/mr可以理解成单位质量的内标响应值和单位质量的外标响应值,这两个值在不同的色谱和质谱条件下,是不同的, 但是两者比值f,在同一条件下是恒定的,这也就是内标法的理论基础。

测定含有内标物的待测组分样品溶液,根据内标和待测物色谱峰响应值As和Ai,和已知的内标含量ms,以及f计算样品含量(mi):mi=f×Ai/(As/ms)

这几年大概遇到过内标法实验基本都是这三种形式的,个人感觉还是比较有代表性的,也只有认真理解方法的设计思路,才能更好的帮助自己把控整个实验过程。

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原文由 hujiangtao(hujiangtao) 发表:压哨的作品支持下
谢谢老板??????
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老师,我有个疑问

试验2,样品处理时加入的乙腈是10mL,后面是取3mL过柱。加入的内标量100ng,实际只有30ng,内标计算时按100ng算还是30ng?
之宣
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“基质匹配曲线越来越被诟病,内标法仿佛成为解决基质效应的唯一办法”
这句有问题,基质效应复杂,不是内标法能解决的。
基质效应复杂,是因为不同的化合物基质效应大小不同,不同的基质 基质效应大小也不同。就农残来说,每一种农药对每一种水果蔬菜的基质效应都不同,农药种类很多,水果蔬菜种类也很多,甚至不同产地、不同季节的同一种水果蔬菜基质效应也不同。
采用内标法,可以解决不同基质的基质效应不同问题,但不同化合物基质效应不同还是无解,总不能每一种化合物都加内标吧?同位素内标很贵地说,每一种化合物单独加内标,实验成本和计算复杂度成倍增加,而且市场上能买到同位素内标的农残兽残,数量很有限。
采用基质匹配曲线,可以解决不同化合物基质将效应不同,但不同基质的基质效应不同还是无解,总不能每一种基质都做基质匹配曲线吧?假设一批样品有10种基质,做10组标准曲线是不现实的。
即使内标法和基质匹配曲线同时使用,仍然不能完全消除基质效应的影响。
之宣
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原文由 haloyu(mitor) 发表:老师,我有个疑问试验2,样品处理时加入的乙腈是10mL,后面是取3mL过柱。加入的内标量100ng,实际只有30ng,内标计算时按100ng算还是30ng?
按100ng计算
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原文由 qqqid(qqqid) 发表:“基质匹配曲线越来越被诟病,内标法仿佛成为解决基质效应的唯一办法”这句有问题,基质效应复杂,不是内标法能解决的。基质效应复杂,是因为不同的化合物基质效应大小不同,不同的基质 基质效应大小也不同。就农残来说,每一种农药对每一种水果蔬菜的基质效应都不同,农药种类很多,水果蔬菜种类也很多,甚至不同产地、不同季节的同一种水果蔬菜基质效应也不同。采用内标法,可以解决不同基质的基质效应不同问题,但不同化合物基质效应不同还是无解,总不能每一种化合物都加内标吧?同位素内标很贵地说,每一种化合物单独加内标,实验成本和计算复杂度成倍增加,而且市场上能买到同位素内标的农残兽残,数量很有限。采用基质匹配曲线,可以解决不同化合物基质将效应不同,但不同基质的基质效应不同还是无解,总不能每一种基质都做基质匹配曲线吧?假设一批样品有10种基质,做10组标准曲线是不现实的。即使内标法和基质匹配曲线同时使用,仍然不能完全消除基质效应的影响。
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