主题:【分享】MTT比色法注意

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lijing320323
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注意事项



1. 选择适当得细胞接种浓度和培养时间。

2. 设置调零孔(只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul)。

3. 设置空白孔(细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亚砜)。

4. MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系。

5. 96孔板边缘32孔用无菌PBS填充,因为边缘的32孔中水分蒸发很快,药物易被浓缩,对实验影响大。同时加入PBS液填充后,可以一定程度上保持中间孔的水分。

6. 防止药物与MTT反应。

如果96孔板中加入了具有氧化还原性的药物,比如谷胱甘肽、Vit E、VitC,那建议用PBS将细胞洗洗,否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀,这种效果可能是不需要的。

7. 吸收值分析

在理想的MTT实验中,如果是细胞抑制实验,不加药物处理的空白组的吸收值应该在0.8-1.2左右,太小检测误差占的比例较多,太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。

8. 培养过程中换液

100ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持50h以上,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果。如果培养时间长,在48h应该换液一次。

9. 避免血清干扰

高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。

10. 判断污染

如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大。在加MTT前可以先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的。

11. 加DMSO前要把液体小心吸掉

但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96孔板,2000r,5分钟,然后吸掉上清(如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉。对于贴壁细胞,可以试着将96孔板倾斜30度角,然后用枪尖慢慢吸。
12. MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
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