主题:【已应助】GB5009.5-2016第一法,自动凯氏定氮法方法验证

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冯亚超
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实验室要开展乳制品中蛋白质测定项目,需要进行蛋白质测定方法验证,采用的检测方法为GB5009.5-2016第一法,自动凯氏定氮法。

查阅标准CNAS-TRL-011:2020轻工产品化学分析方法确认与验证指南,方法验证参数参数选择

待评定性能参数典型选择一般要求
检出限*不高于方法标准给出的检出限
定量限不高于方法标准给出的定量限
线性范围曲线线性相关系数满足标准规定或通用要求
测量范围

应覆盖方法的最低浓度水平(定量限)和关注浓度水平
精密度(重复性和再现性)精密度数据采用χ2验,或优于标准方法给出的指标或满足化学分析通用要求
正确度偏倚小于临界差(CD  值)或回收率优于标准方法给出的指标或满足化学分析通用要求
1*表示在进行痕量分析是时需要验证此性能参数。2:“”表示正常情况下需要验证的性能参数;3:当标准方法没有特别规定的情况下,如已经验证检出限,定量限可以省略;当已经确认线性范围,测量范围可以省略。



方法验证的方案设计中遇到问题为:

1)GB5009.5-2016第一法中没有“检出限与定量限”的规定要求这个检出限需要做吗?

2)“精密度”的要求 “在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。”精密度进行实施的时候,这个“独立测定结果”如何理解呢?
这样理解对吗:“实验室内同一个人同一台仪器,分别称量样品、分别进行前处理,进行两次平行测定结果”


但是这个帖子里(https://bbs.instrument.com.cn/topic/7004257)“食品中蛋白质的测定方法验证”中采用人员比对验证了该精密度的要求,两个人独立测定结果的绝对差值除以算术平均值。两个人独立测定是否满足“重复性条件下”这个表述?

3)“线性范围”与“测量范围”的验证
我的理解:先确定 “关注浓度水平”,比如巴氏杀菌如蛋白质的最低限量为蛋白质(牛乳)≥2.9g/100g(GB19645-2010食品安全国家标准巴氏灭菌乳标准),2.9g/100g就是关注浓度水平。
根据CNAS-TRL-011:2020中5.3与5.4对“测量范围与线性范围”实施方法的描述
5.3测量范围
方法的测量范围通常应满足以下条件:
a) 方法的测量范围应覆盖方法的最低浓度水平(定量限)和关注浓度水平;
b) 至少需要确认方法测量范围的最低浓度水平(定量限)、关注浓度水平和最高浓度水平的正确度和精密度,必要时可增加确认浓度水平;
b)  若方法的测量范围呈线性,也可通过线性范围的评定来验证测量范围。
5.4 线性范围
线性范围通常可参照相关国家标准或国际标准,尽量满足如下要求:
a) 采用校准曲线法定量,一般应具有 6 个校准点(包括空白)。对于筛选方法,线性回归方程的相关系数不低于 0.98。对于准确定量的方法,线性回归方程的相关系数不低于0.995;
b) 校准用的标准点应尽可能均匀地分布在关注的浓度范围内并能覆盖该范围;
c) 浓度范围一般应覆盖样品中可能涉及的分析物浓度或关注浓度的 50%~150%,如需做
空白时,则应覆盖关注浓度的 0~150%;


结合凯氏定氮法的要求:本人对线性范围与测量范围的验证方法实施理解为:线性范围为关注浓度水平(2.9g/100g)的50%~150%。
请老师帮忙确认下这个理解是否正确?

最佳答案:快乐回复于2021/04/05
1、做方法法验证,不一定按照上面一模一样去做,应该具体您的样品是什么,如牛奶含量大概是2.8-3.4%,您线性范围就可以做1.5-5%,只要包含您的样品浓度范围就可以,如所测样品粗蛋白为40%,您做1%含量的粗蛋白含量就没有意义,也就是说,这种情况下,做检出限没多少意义。如果样品含量很低,接近检出限,就哪一定要做检出限和定量限,其实CNAS-TRL-011:2020中定义的检出限和定量限,一般是指气相、液相、质谱、原吸之类的仪器。
若一定要做,测量氮元素范围:0.1mg-210mg
2、精密度可按硫酸铵标准溶液或实际样品,重复测量6次,计算相对标准偏差,硫酸铵标准溶液的结果要小于0.5%,样品的自己单位根据经验和含量规定一个值。
3、测量范围:个人觉得没有必要做标准曲线,定氮仪不适合。测量范围可以用不同浓度的标准样品和硫酸铵来看回收率,但浓度一定要覆盖所测样品的含量范围。
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原文由 冯亚超(Insm_98346adf) 发表:

谢谢老师的指导!您对方法验证的理解很深刻,我的疑惑已经解决!

再问一个问题:您说的“测量氮元素范围:0.1mg-210mg”,这里的数值有出处吗?是参考什么计算出来的呢?
这个一般是仪器给出的测定范围
冯亚超
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原文由 启航2021(uil1010) 发表:
3)“线性范围”与“测量范围”的验证
我的理解:先确定 “关注浓度水平”,比如巴氏杀菌如蛋白质的最低限量为蛋白质(牛乳)≥2.9g/100g(GB19645-2010食品安全国家标准巴氏灭菌乳标准),2.9g/100g就是关注浓度水平。
根据CNAS-TRL-011:2020中5.3与5.4对“测量范围与线性范围”实施方法的描述 。

关注水平一般特指预估的被测对象中待测项目的浓度预期值,按这个浓度的0.5至1.5配置校准曲线。但这个有时候不容易获得,就转变为产品质量控制上下限,按下限的0.5,上限的1.5配置校准曲线。
谢谢老师指点!
冯亚超
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原文由 快乐(ynsfeed) 发表:
1、做方法法验证,不一定按照上面一模一样去做,应该具体您的样品是什么,如牛奶含量大概是2.8-3.4%,您线性范围就可以做1.5-5%,只要包含您的样品浓度范围就可以,如所测样品粗蛋白为40%,您做1%含量的粗蛋白含量就没有意义,也就是说,这种情况下,做检出限没多少意义。如果样品含量很低,接近检出限,就哪一定要做检出限和定量限,其实CNAS-TRL-011:2020中定义的检出限和定量限,一般是指气相、液相、质谱、原吸之类的仪器。
若一定要做,测量氮元素范围:0.1mg-210mg
2、精密度可按硫酸铵标准溶液或实际样品,重复测量6次,计算相对标准偏差,硫酸铵标准溶液的结果要小于0.5%,样品的自己单位根据经验和含量规定一个值。
3、测量范围:个人觉得没有必要做标准曲线,定氮仪不适合。测量范围可以用不同浓度的标准样品和硫酸铵来看回收率,但浓度一定要覆盖所测样品的含量范围。


谢谢老师的指导!您对方法验证的理解很深刻,我的疑惑已经解决!

再问一个问题:您说的“测量氮元素范围:0.1mg-210mg”,这里的数值有出处吗?是参考什么计算出来的呢?
快乐
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原文由 冯亚超(Insm_98346adf) 发表:
首先感谢您的指导,两个标准关于该部分的描述基本一致,我的疑问还是不能从这个标准中得到解决!
1、做方法法验证,不一定按照上面一模一样去做,应该具体您的样品是什么,如牛奶含量大概是2.8-3.4%,您线性范围就可以做1.5-5%,只要包含您的样品浓度范围就可以,如所测样品粗蛋白为40%,您做1%含量的粗蛋白含量就没有意义,也就是说,这种情况下,做检出限没多少意义。如果样品含量很低,接近检出限,就哪一定要做检出限和定量限,其实CNAS-TRL-011:2020中定义的检出限和定量限,一般是指气相、液相、质谱、原吸之类的仪器。
若一定要做,测量氮元素范围:0.1mg-210mg
2、精密度可按硫酸铵标准溶液或实际样品,重复测量6次,计算相对标准偏差,硫酸铵标准溶液的结果要小于0.5%,样品的自己单位根据经验和含量规定一个值。
3、测量范围:个人觉得没有必要做标准曲线,定氮仪不适合。测量范围可以用不同浓度的标准样品和硫酸铵来看回收率,但浓度一定要覆盖所测样品的含量范围。
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3)“线性范围”与“测量范围”的验证
我的理解:先确定 “关注浓度水平”,比如巴氏杀菌如蛋白质的最低限量为蛋白质(牛乳)≥2.9g/100g(GB19645-2010食品安全国家标准巴氏灭菌乳标准),2.9g/100g就是关注浓度水平。
根据CNAS-TRL-011:2020中5.3与5.4对“测量范围与线性范围”实施方法的描述 。

关注水平一般特指预估的被测对象中待测项目的浓度预期值,按这个浓度的0.5至1.5配置校准曲线。但这个有时候不容易获得,就转变为产品质量控制上下限,按下限的0.5,上限的1.5配置校准曲线。
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1)GB5009.5-2016第一法中没有“检出限与定量限”的规定要求这个检出限需要做吗?如果做方法验证,或者是申请扩项,或者从质量控制角度,空白试验都是需要做的,做检出限可以验证实验室的检测能力!

2)“精密度”的要求 “在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。”精密度进行实施的时候,这个“独立测定结果”如何理解呢?这样理解对吗:“实验室内同一个人同一台仪器,分别称量样品、分别进行前处理,进行两次平行测定结果”

可以这样理解,独立就是两个样品间互不影响,其中包括不能在同一个校准曲线下接替测试。应该独立绘制自己的校准曲线,一般使用同一套校准溶液,分别绘两次曲线。
严格意义的重复性条件应该是同一个人操作。但是,对于部分试验同一个人操作不容易实现,或者不常实现,转变为同一个实验室,短期内,也是可以的。这就是另外一个标准中关于重复性条件的解读。
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原文由 快乐(ynsfeed) 发表:
为什么不采用这个:GB/T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南
首先感谢您的指导,两个标准关于该部分的描述基本一致,我的疑问还是不能从这个标准中得到解决!
快乐
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为什么不采用这个:GB/T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南