主题:【资料】CNS_00.007_咖啡因

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张添齐

咖啡因的应用与检测进展

二〇二一 年 七 月

摘要

咖啡因(Caffeine),属生物碱性化合物,主要分布于茶叶、咖啡豆等植物的幼嫩组织部位。因作用于人体中枢神经系统,使机体产生兴奋作用,被广泛用于药物及食品中。作为作为国家管制精神药品物质的咖啡因,其管制力度远低于其他滥用药物,但近些年由于咖啡因摄入过量而造成的死伤案例逐渐增多。因此了解咖啡因的性质与用途,了解它的检测方法对于食品安全及法医鉴定中均具有重要的意义。本文将从理化性质、应用与危害、检测方法等方面对咖啡因进行介绍,从而帮助本文的阅读者更好的了解咖啡因这种生活中常见的添加剂。




关键词:咖啡因 检测方法 理化性质 应用




1 咖啡因的介绍

咖啡因(咖啡因ffeine), 1,3,7-三甲基黄嘌呤是茶叶、咖啡豆等天然植物中常见的一种黄嘌呤类生物碱化合物,在人们生活中普遍存在, 主要分布于茶叶、咖啡豆等植物的幼嫩组织部位,纯品味苦,为白色粉状物质。咖啡因既被广泛用于药物中,也常见于食品中,如红牛等功能性饮料及茶叶、咖啡等饮品中都含有咖啡因成分, 在天然水中也有微量存,与人类生活息息相关。

咖啡因可驱除疲劳、兴奋神经临床上常用于治疗神经衰弱和昏迷复苏,是世界上使用最为广泛的精神活性药物,但因其成瘾性及神经损害性等而被列入国家管制的精神药品范围咖啡因作为国家管制的精神药品物质,其管制力度远低于其他滥用药物,具有安全范围较大、不良反应轻微的特性。适量摄入有益于运动和神经功能,可缓解疲劳,醒脑提神。但若使用过量(>400mg),则出现紧张、多尿、失眠、烦躁、血压升高、呼吸加快、心率过快等症状。长期或大量使用会对机体产生以下危害: 一是作用于人体中枢神经系统并造成不同程度的损害; 二是可能会引发心脏病和高血压等慢性疾病; 三是具有成瘾性,一旦停用可表现短期或数日头痛或不适,浑身乏力疲惫,精神萎靡等各种戒断症状,摄入中毒剂量可引起阵挛性惊厥,严重者可致死亡,长期大量摄入则产生重度成瘾性[1]

近些年,因咖啡因摄入过量而造成的急诊抢救、死亡案例逐渐增多,国内外也出现咖啡因中毒案件的报道。尤其是使用者在与乙醇混用后,将会产生后果更为严重的中毒症状。咖啡因 体内代谢过程复杂,几乎都是经肝脏代谢,在多种酶的作用下生成多种嘌呤和尿酸类产物,现已发现其 15 种代谢产物。3 种主要代谢产物:副黄嘌呤 (paraxanthine, PX)、茶碱(Theophylline, TP) 和可可碱(Theobromine,TB)同咖啡因一样,均属于黄嘌呤类,是嘌呤代谢后的产物 (嘌呤衍生物),广泛分布于人体体液中。咖啡因及其代谢物重要的科研应用价值一直受到普遍关注,其在食品药品安全研究、 医鉴定及临床检验中均具有重要的意义。





2 咖啡因的理化性质

咖啡因化学名为1,3,7-三甲基黄嘌呤,或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮。咖啡因有无水品和水品两种,前者主要用途是药物、能量保健品、饮食;后者的主要用途是测定锑、钯、金、铋等金属元素,咖啡因的应用范围广泛,本文介绍的为无水咖啡因,其分子式: ,分子量:194.19,其结构式如下:









其理化性质如下:白色粉末结晶、熔点为238℃,178℃升华,碱性物质。在乙酸乙酯、氯仿、嘧啶、吡咯、四氢呋喃、乙醇、丙酮中易溶,水、石油醚、醚及苯中微溶,可由茶叶、咖啡果中提取或人工合成。



3 咖啡因的应用与添加限量

3.1 咖啡因的药理学应用

咖啡因主要用于对抗中枢抑制状态,如严重传染病、镇静催眠药过量引起的昏睡及呼吸循环抑制等,可肌肉注射苯甲酸钠咖啡因。此外,咖啡因还常配伍麦角胺治疗偏头痛:配伍解热镇痛药治疗一般性头痛。此时,它由于能够收缩脑血管,减少脑血管搏动的幅度而起到加强以上药物止痛效果的作用。

3.1.1 提神养脑

咖啡因会刺激脑部的中枢神经系统,延长脑部清醒的时间,使思路清晰、敏捷,且注意力较为集中,可提高工作及学习的效率。



3.1.2 兴奋中枢神经系统作用

Kansas医学院神经系Wilse Robjnso 1912年研究表明,茶叶中咖啡碱能兴奋中枢神经,使大脑外皮层易受反射刺激,从而改良心脏的机能,能使思维敏捷,提高思维效率,消除疲劳感。茶叶中咖啡碱的兴奋作用比较温和,且由



咖啡碱在人体内能够迅速转化和排除,滞留不超过24h,因此比较安全,对人体不产生积蓄性毒害作用。

3.1.3 控制体重

咖啡因能提高人体消耗热量的速度,一项研究发现100毫克的咖啡因(约1呗咖啡),可加速脂肪分解,能使人体的新陈代谢率增加百分之三至四,增加热能的消耗,适量饮用,有减重效果。

3.1.4 利尿、醒酒作用

咖啡碱通过肾脏促进尿液中水的滤出率实现利尿作用,并且刺激膀胱来协助人体排尿。能兴奋血管运动中枢,使肾血管壁舒张,提高肾脏血管流量,增加了肾小球的过滤量。同时,咖啡碱及其同系物对肾小管的再吸收有抑制作用,提高了对机体无用或有害物质的排出量,提高这种物质的排出量对心脏性水肿,月经前综合症以及水滞留等有显著疗效。对防治肾结核和结石有良好作用。

3.1.5 保护心脑血管

咖啡因可抑制环磷酸腺苷转化为环磷酸鸟苷,从而扩张血管,增加管壁弹性,促进血液循环。有研究证明,脑血流量与咖啡因的摄入量是成正比关系,且长期慢性的每日饮用咖啡与罹患中风的危险性呈显著的反比。

有专家研究认为咖啡因兴奋的水平与增加的皮肤电导水平、增加的呼吸频率以及一功率的整体减弱有关,且未引起由咖啡因诱导的显著的心血管兴奋效应。

3.1.6 止疼

咖啡因作为一个药品时,可以加强某些止痛剂的效果。

3.1.7 增强身体捷度

咖啡因也有助于在运动时,使运动阀值降低,增加身体的敏捷度,使运动员缔造较好的成绩。

3.1.8 消毒灭菌,抵御疾病

咖啡碱本身有灭菌及病毒灭活功能。茶中咖啡碱对大肠杆菌、伤寒及副伤寒杆菌、肺炎菌、流行性霍乱和痢疾原菌的发育,都有抑制功能,特别对牛痘、单纯性疱疹、脊髓灰质炎病毒、B1和B2型柯萨克肠道系病毒,l1型埃柯病毒的活性有抑制效果。


3.2 咖啡因在生活中的应用

咖啡因在我们的日常生活中并不少见,它被作为食品添加剂而广泛地应用于饮料中。除咖啡外,含咖啡因的饮料非常多,其中一类是饮料中天然存在的咖啡因,如可可、茶,另一类是将咖啡因添加在饮料中,如某些汽水、果汁。

3.2.1 咖啡

咖啡有提神醒脑的效果,因为其中含有咖啡因。在美国,差不多75%被服用的咖啡因是来自咖啡。一般来说,市场上一杯普通中杯装即磨咖啡,含有150至200毫克咖啡因,一袋速溶咖啡中咖啡因约为66毫克。

3.2.2 茶

我们常喝的各种绿茶、红茶、乌龙茶等,都含有咖啡因。茶中咖啡因含量与泡茶方法、时间有关,绿茶的咖啡因含量从每杯(约227克)30毫克至50毫克不等。红茶平均每杯含咖啡因约47毫克。

3.2.3 汽水

很多汽水饮料以及功能性饮料都含有咖啡因,一罐330毫升的可乐咖啡因含量约有33毫克。由于某些功能性饮料含有咖啡因,会刺激中枢性神经,因此不是所有人群都适宜喝功能性饮料,儿童尤其应注意。

3.2.4 巧克力

巧克力中的咖啡因含量相对较少,以至于人们常常将其忽略。一块约40克的牛奶巧克力含有相当于6毫克的咖啡因,另外,巧克力味及咖啡味的牛奶、雪糕、乳酪等也可能含有咖啡因。


3.3 咖啡因的危害与添加限量

较大剂量的咖啡因能兴奋呼吸中枢,血管运动中枢和迷走神经中枢,使血压略升,心率减慢,但作用时间短暂,常被其对心脏与血管的直接作用所拮抗;大剂量时可兴奋包括脊髓在内的整个中枢神经系统;中毒量可引起强直或阵挛性惊厥,甚至死亡。常见异常表现如下两大类:

3.3.1 造成瘾性行为

咖啡因直接作用于大脑皮层,动物首次使用敏感性强,提高精神、解除疲劳、增强肌肉力量等治疗作用;但频繁服用产生依赖性、耐药性,成瘾,并逐渐增高用量,一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状。

3.3.2引起中毒反应

咖啡因剂量大或给药过频不仅会损害内脏器官、诱发呼吸道炎症、骨骼震颤而且刺激胃粘膜,使其胃液量和酸度增加,导致消化性溃疡,糜烂性食道炎和胃食管反流病。另外兴奋延髓呼吸中枢、血管运动中枢和迷走神经中枢,引起强直或阵挛性惊厥,甚至导致吸食者下一代智能低下,肢体畸形,动物药代动力学研究表明,咖啡因在血浆中水平达到或超过60mg/mL致癌。咖啡因中毒症状包括烦躁、神经过敏、兴奋、失目民、脸红、流涎、尿频、腹痛、肌肉抽搐、思维涣散、心跳不规则或躁动等一系列身体与心理不良反应,甚至有身亡的危险。

3.3.3 咖啡因的添加限量

由此可见,咖啡因作为一种食品添加剂,其添加含量应当有着严格限制。下图为各种饮料中的咖啡因的标准含量:





4 咖啡因的检测方法与标准介绍

4.1样品前处理

咖啡因及其代谢物的检测研究多集中在血浆/血清、尿液和唾液等生物检材中,其他检测样本还有饮料 茶和药剂等。液-液萃取法(Liquid- liquid ex-traction, LLE)是当前 咖啡因 及其代谢物前处理最常用的方法,多用于血浆/血清和唾液的样本处。该法操作简单,但用时多工作量大,有机溶剂 消 耗 量 大。常 用 的 有 机 萃 取 试 剂 有 甲、 乙腈以及三氯甲烷和异丙醇的混合(90∶10 )85∶15)三氯甲烷:异丙醇混合液的混合比例不同会直接影响 咖啡因 及其代谢产物的萃取效率,90∶1085∶15配比是比较常见的比例

另外,LLE常需要酸化样本,主要作用有二:一是可以稳定样本中咖啡因的代谢产物,少其生物降解;二是酸化样本可提高待测物的萃取回收率LLE法外,固相萃取法(Solid- Phase Extraction, SPE)也是咖啡因及其代谢物检测样本前处理常用的处理方法,多见于尿液或废水等溶液样本处理中。SPE法作为样本净化和富集的有效方法,相对于 LLE, 有机溶剂用量少,便捷安全、高效,且分析物回收率相对较高,分析结果重现性好,在极性强、小分子物质及复杂物质的萃取方面有着较强的优势。但是 SPE 萃取柱造价高,费用贵,使用寿命短,因而消耗大,给普通实验室样本的前处理带来较大的经济压力。此外,尿液标本也可经酸化、甲醇脱蛋白、离心除杂质,取上清液进入液相色谱系统检测另外,也有直接沉淀法处理样本的报道, 操作中直接往样本中加入高氯酸,震荡离心,再用适当的碱中和多余的高氯酸, 然后直接进色谱分析系统分析。方法简单、快速、低廉, 为咖啡因及其代谢产物的检测提供了一条经济的样本前处理方案。

还有研究中采用搅拌棒吸附萃取(Stir bar sorptive extraction, SBSE)的方法处理样本,SBSE具有灵敏度高、重现性好、不使用有机溶剂等优点,适用于食品、 环境、生物样品中挥发性及半挥发性有机物的痕量分析。就咖啡因及其代谢产物的萃取方面而言,SBSE 取设备可以大大减少咖啡因及其代谢产物的萃取流程,实现待测物的直接提取。缩短流程、节省时间但目前应用还未得到推广。


4.2 咖啡因的检测方法

咖啡因研究最早采用的检测方法是碘量滴定法,在待测液中加入定量标定的碘液,利用氧化性和还原性,酸性条件下咖啡因碘生成不溶性过碘化物用硫代酸钠滴定剩余的碘后换算分析。传统方法操作复杂、误差大、准确性较低。在仪器分析快速发展的背景下,以操作简便、精确度高、检测限低等为目标的仪器分析手段也逐步用于咖啡因的检测研究,主要方法包括光谱法、色谱法、联用技术及毛细管电泳技术等。

4.2.1 光谱法

光谱法是通过对物质内部量子化的能级因跃迁而产生的散射、辐射、发射及吸收的强度和波长进行分析的方法。根据咖啡因的物质性质,适用于其检测的光谱法主要是紫外光谱法、红外光谱法等。

4.2.1.1 紫外光谱法

紫外光谱法应用于生物碱的测定较早,其利用含有共轭双键的化合物在紫外光区吸收紫外光后,易于被激发产生跃迁的特性,对物质分子价电子从低能级向高能级跃迁的过程中在紫外光区形成不同特征性的特征峰而进行物质分析。由于紫外光谱法具有因人员操作不同影响准确度等弊端,其使用范围有较大的局限性,用于检测制剂中咖啡因含量的研究也相对较少。

2011 年孙爱霞 [2]测定可乐型饮料中咖啡因的含量,采用紫外分光光度法,实验中探索出最佳的测定条件为:20ml×4三氯甲烷萃取,萃取温度以20-40℃为宜,采用5g无水硫酸钠过滤脱水,在276.5nm波长下测其吸光度值,紫外分光光度法的回收率为96.3%-105.9%,变异3.2%,萃取温度以20-40℃ 为宜,最大吸收峰在276.5nm处,实验表明,简单迅速,适合一般实验室应用。

4.2.1.2 红外光谱法

红外光谱法是分子吸收光谱的一种,通过对化合物的红外光谱分析条件下进行有机官能团的鉴定,是经典的有机结构分析方法之一,其研究对象样品可由化合物转为复杂混合物。红外光谱法应用于毒物与毒品的检测,国内最早可以追溯于九十年代,具有无损检验、样品无须前处理、所需检材量小、分析速度快、操作简便等优点,但其对于咖啡因物质的检测效果不佳等因素,被应用于该领域的研究热度不高。

2009 年杨捷[3]内标物选用铁氰化钾,称取定量咖啡因对照品,分别加入相同量的铁氰化钾和溴化钾,充分研磨并混合均匀,配制成标准系列,选择咖啡因中不受干扰的特征吸收峰羰基峰和铁氰化钾中的特征吸收峰氰基峰,测定吸收光谱,线性回归分析咖啡因特征峰吸光度与铁氰化钾特征峰的吸光度的峰高之比与其对应浓度,绘制标准曲线,再以相同方法测定咖啡因待测样品,标准曲线得待测咖啡因的浓度,线性范围10-250mg/g,相关系数R=0.9953;采用该方法对样品进行测定的结果与 HPLC 方法比较得到较满意的结果,平均回收率为 98.0%-100.5%,该方法准确、可靠,可快速定量分析咖啡因及其他固体物质。

4.2.2 色谱法

色谱法是利用各组分在性质及结构上的差异,以色谱体系中的固定相发生作用力的大小、强弱进行区分,在同一力的推动作用下,不同组分在固定相中的滞留时间长短,以先后顺序从固定相中流出,从而使各组分得到分离的分析方法。用于咖啡因的检测的色谱法主要分为液相色谱法和气相色谱法。

4.2.2.1液相色谱法

相色谱法运用于咖啡因的检测,国内最早见于20世纪80年代液相色谱法的流动相为液体,具有检测限低、分离效果佳、定量准确性好、应用范围广等特点。因此,液相色谱法检测咖啡因的研究受到广泛关注,并呈逐年上升趋势,2006年左右达到研究高峰。目前,液相色谱法测定咖啡因的含量在国内外应用较为广泛,既是国际通用方法,同时也为国家标准釆用。同时,检测目标物也从药物中的咖啡因检测逐渐转化为饮料或食品中的咖啡因检测,可见,对咖啡因的认识和关注得到了更为广泛的重视。

在食品中咖啡因检测方面,2014 年李蔚[4]不同饮品中的咖啡因含量检测,使用高效液相色谱法,用水提取可乐型饮料、含乳及不含乳的咖啡及茶叶液体制品、咖啡、茶叶及其固体制品等样品,经不同前处理净化,以Sym-metryS hieldC18反相色谱柱(3.9mm×150mm×5μm)分离,二极管阵列检测器检测,保留时间定性,外标法定量分析,咖啡因在220ng/ml-439μg/ml 浓度范围内与峰面积呈良好线性关系(R=0.9998),检出限0.7ng(S/N =3),平均回收率为90.2%-107%,RSD=0.37%3.8%(n=6),方法灵敏度高、准确性好、重现性佳,科学性、操作性好,可用于测定不同饮品中咖啡因的含量。

此外,在药物中咖啡因含量检测方面,陈健[5]测定复方氨酚烷胺片中种组分对乙酞氨基酚、盐酸金刚烷胺、咖啡因和马酸氯苯那敏含量,色谱柱为C1 8,柱温30℃,流动相为甲醇(0.01mol/L)-乙酸铵溶液(13∶87,pH=3.0),流速为1.0ml/min,进样量20μl,检测波长220nm,5.1-102.0μg/ml线性范围内咖啡因线性关系良好,该方法方便、高效,准确度、灵敏度、稳定性、回收率值均符合分析测定要求。

4.2.2.2 气相色谱法

气相色谱分析法是流动相为气体的色谱分析方法,其具有高灵敏性和选择性、取样量少、分析快速、准确等特点,但其对样本进样的条件较为严格,经过长期发展气相色谱逐步成为毒品及微量检测重要方法之一。

在食品检测方面,2004年陈春晓[6]利用气相色谱法测定饮料中的咖啡因,结果显示,浓度范围0-1000μg/ml咖啡因呈线性关系,R=0.9998,最低检出限 1mg/kg(以2倍噪声计),经检测,含有咖啡因的饮料样品中多数含量为0.10g /kg-0.25g/kg,以可乐型饮料及功能型饮料为主,且饮料中的其他成分对本实验均无干扰,同一产品的咖啡因含量监测多年的结果基本稳定,但不同产地的同一品牌饮料检测结果有较明显的差异。

在药物检测方面,2007年姚如心[7]同时测定复方阿司匹林制剂中阿司匹林、对乙酰氨基酚、咖啡因及降解产物水杨酸,采用大口径毛细管气相色谱法,分别考察了不同极性的填充柱、石英毛细管柱和530μm大口径毛细管对阿司匹林、对乙酰氨基酚、咖啡因和水杨酸的色谱效度,结果表明,大口径毛细管柱均好于填充柱和毛细管柱,且其分析时间仅为同等长度填充柱的五分之一,柱长较短的非极性大口径毛细管柱不仅灵敏度高,而且具备出峰速度快、分离效果好的优点。

4.2.3 联用技术

联用技术分析方法具有分离分析效能高、速度快及灵敏度高、操作简便、成本相对低等特点,使其在很多领域得以应用和推广[8]。联用技术分析方法运用于茶叶、药物中咖啡因的检测,具有较好的效果,能够快速、准确的测定咖啡因的含量。

在食品检测方面,丁明珍[9]建立自发溶剂微萃取的样品与气相色谱质谱联用分析饮料中咖啡因含量的分析方法,使用自动进样器进样,样品经自发混合萃取后取下层萃取液进样分析,咖啡因的线性范围0.001-20mg/L,R=0. 9999,RSD<2%,检测限0.0001mg /L,回收率为 99.0%-104.8%,该方法准确、简便,样品机溶剂消耗少,能够实现自动化检测,可用于批量测定咖啡因在饮料中的含量。王丽艳[10]利用 GC/MS联用技术检测茶饮料中咖啡因,外标法定量,选择离子扫描选取 m/z 为67、82、109、194四种离子,结果表明,定性结果准确,定量方法可行,回收率、精密度均在限定范围内。

在药物检测方面,柴龙龙 [11]建立大鼠血浆中对乙酰氨基酚、咖啡因、异戊巴比妥的LC-MS/MS检测方法,并应用于新复方大青叶片在大鼠体内的药代动力学研究,其中咖啡因的线性范围0.01-10μg/mL,检测限为0.01μg/mL,精密度和准确度在15%以内。

4.2.4 电泳法

毛细管电泳技术发展于20世纪80年代后期,于20 世纪 90 年代成为最重要的现代分离分析方法之一,其是利用毛细管为分离通道,驱动力是高压直流电场的液相分离技术,具有分离效率高、操作简便等特点,已被广泛地应用于医学、药学、分子生物学、材料学及食品、环保、化工等各个领域。来分离测定汽水中咖啡因、苯甲酸、山梨酸、糖精,结果可在12min内使各组分发生分离。

在食品检测方面,孙保[12]建立了胶束电动毛细管电泳法(MECC)检测饮料中山梨酸、苯甲酸、10-羟基癸烯酸、咖啡因和糖精钠五种添加剂,对电压、缓冲溶液浓度和pH值、胶束浓度与分析结果的影响进行研究,结果表明,迁移时间和测定回收率的变异系数分别小于1.5%和5%,检测限分别为10,10,5,10,20μg/kg。

在药物检测方面,徐芳[13]采用胶束电动毛细管电泳法对咖啡因等6种生物碱进行检测,在35mmol/L十二烷基硫酸钠(SDS)-10mmol/L硼砂(pH9.0)运行缓冲液中进行电泳离,20℃,18kv电压,检测波长 270nm,6种碱基8min内实现基线分离,10-500mg/L浓度范围内线性关系良好,R = 0.9995-0.9999,检出限12.5-100ug/L,回收率为96.1%-105.2%,方法灵敏度高,快速简便,可用于分析和测定药物和饮料中的生物碱。


5 咖啡因检测的发展趋势



咖啡因的检测方法各有优劣,从早期采用传统检测碘量法、纸层析法、重量法等检测方法到光谱分析法再发展到现代的色谱法及联用技术的测定,技术层面上分析方法的结果准确性得到了很大的提高,灵敏度也有大幅度的提升。但同时,现代分析方法具有前期处理条件较为严格,分析过程复杂,耗时长及分析费用相对较高等特点。因此,在分析方法发展迅速的背景下,在原有检测方法基础上,综合各方法的优势并加以利用,建立快捷、准确、高灵敏度的多种食品、药品及生物检材中咖啡因及其代谢产物定性定量分析方法,在食品药品安全研究及监测以及临床诊断、 法医鉴定中均具有重要的意义,为临床诊断及法医学鉴定实践提供指导信息。咖啡因作为药物代谢酶活性测定的探药,且其使用与生命健康的关系也很紧密, 使得咖啡因及其代谢产物在科研中的应用也随着技术的发展而得到逐步的开发推广。鉴于咖啡因及其代谢产物在人们生活中的普遍存在,其与人体健康的相关研究是值得永恒探索的问题。

参考文献

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[2] 孙爱霞.可乐型饮料中咖啡因的测定[J].职业与康,2011,(16).

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[13] 徐芳,陈波,姚守拙.胶束电动毛细管电泳法分离6种生物碱基[J].药物分析杂志,2008,(05).

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[15] 王乐,贾宗平,赵文成,杨亚飞.咖啡因检测方法研究进展[J].云南警官学院学报,2019(01):19-27.

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