主题:【第十四届原创】GB 5009.32-2016测定抗氧化剂的方法优化

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GB 5009.32-2016测定抗氧化剂的方法优化

要: 抗氧化剂作为食品添加剂可以帮助防止食品变质,但摄入过量会对人体有害,因此对抗氧化剂的检测非常重要。目前食用油抗氧化的测定国抽实施细则按照国标GB 5009.32-2016 《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》第一法高效液相色谱法的前处理操作,9种抗氧化剂的回收率都较差,因此,本文就此分享一下优化的过程,顺便给大家讲述一下,使用SPE进行前处理,回收率不好时的一些优化步骤。

关键词食用油抗氧化GB 5009.32-2016回收率

1 固相萃取小柱的选择和分布收集

在国标GB 5009.32-2016中,采用的是C18固相萃取柱,在SPE操作过程中,分布收集是一种非常实用的实验技巧,分布收集就是通过收集上样液、淋洗液、洗脱液甚至进行二次洗脱,并上机分析,从而判断目标化合物具体损失的环节,明确实验步骤中具体需要优化的环节。

根据以上讲述,确定实验方案进行实验,得出了实验数据。

基质植物油

准确称取混合均匀的试样1g(精确至0.01 g)于50mL离心管中,加标(1000ppm100ul),加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品,涡旋1min,静置10min,用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min3000r/min离心5min,收集乙腈层于另一50mL离心管中,再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次,合并3次提取液,待上样。(实验过程记得避光操作)

净化

小柱: C18 SPE 小柱500mg/6mL

活化:5ml甲醇

平衡:5ml乙腈

上样:全部待净化液 ,收集

洗脱:5ml乙腈:甲醇(2:1),收集

二次洗脱:10ml乙腈:甲醇(2:1),收集

氮吹浓缩:全部上样液和洗脱液一起收集浓缩,在40℃下旋蒸至1ml左右,转移至15mL离心管中,用少量乙腈润洗旋蒸瓶3次,合并后40℃氮吹至0.5mL,用乙腈定至2mL,涡旋30s,过0.22um PVDFPTFE滤头后,用高效液相色谱仪配二极管阵列检测器测定。

平行样每个做一个基质空白,两个基质加标,其实验结果如下:

名称

基质加标回收率%

1

2

3

4

5

6

7

8

9

PG

THBP

TBHQ

NDGA

BHA

Ionox-100

OG

DG

BHT

C18 小柱基质加标上样-1

78.85

72.04

38.10

81.50

85.60

86.60

76.00

73.80

57.10

C18 小柱基质加标上样-2

84.60

75.80

44.40

84.40

89.80

88.80

83.10

81.10

62.30

C18 小柱基质加标洗脱-1

7.40

8.50

0.00

5.30

2.80

3.50

8.90

10.80

3.70

C18 小柱基质加标洗脱-2

5.80

10.00

0.00

6.00

1.20

1.40

6.60

9.30

3.30

C18 小柱基质加标二次洗脱-1

0.00

0.00

0.00

0.00

0.20

0.60

0.10

0.00

1.10

C18 小柱基质加标二次洗脱-2

0.00

0.00

0.00

0.00

0.10

0.60

0.10

0.10

0.40

通过以上实验数据,我们可以看到上样液中检测到大部分的目标物,C18小柱对9种抗氧化剂的保留率都非常低,二次洗脱中有少量的目标物,而且比较上样、洗脱和二次洗脱回收率之和可以发现,HC-18TBHQBHT的回收率均较低

GB 5009.32-2016明确写道:

这里再次说明下固相萃取小柱有两种工作模式:一种是除杂模式:如C18小柱,农药残留用的小柱等,还有一种是洗脱模式:如着色剂小柱,瘦肉精用的MCX小柱等;GB 5009.32-2016c18小柱的工作模式误认为是洗脱模式了,所以才会出现将上样液给予弃去的情形。

因此,接下来的实验就需要增加洗脱液体积,上样液和洗脱液一起接收,并且想办法提高TBHQBHT的回收率。

2  添加保护剂

为什么TBHQBHT的回收率依然低通过查阅资料和文献,终于在一份行业标准中发现了秘密,在行业标准SNT3849-2014《出口食品中多种抗氧化剂的测定》中,在进行抗氧化剂的提取时,它在提取溶剂正己烷饱和的乙腈中添加了L-抗坏血酸棕榈酸酯(AP),L-抗坏血酸棕榈酸酯( AP) 对金属离子有螯合作用能够促进氧化的微量金属离子钝化,从而降低抗氧化剂在提取和浓缩过程中被氧化的程度, 减缓抗氧化剂的氧化速率,提高回收率。另外,在试验确定的检测条件下 AP 不会对其他抗氧化剂造成干扰。

又进行了一次实验,添加AP和不添加AP 进行比较,实验方案和实验数据如下。

基质 植物油

AP的正己烷饱和的乙腈溶液:1L正己烷饱和的乙腈中溶解0.1gL-抗坏血酸棕榈酸酯(AP)

前处理1准确称取混合均匀的试样1g(精确至0.01 g)于50mL离心管中,加标(1000ppm,100ul),加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品,涡旋1min,静置10min,用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min3000r/min离心5min,收集乙腈层于另一50mL离心管中,再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次,合并3次提取液,待上样。(实验过程记得避光操作)

前处理2准确称取混合均匀的试样1g(精确至0.01 g)于50mL离心管中,加标(1000ppm,100ul),加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品,涡旋1min,静置10min,用5mLAP的正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min3000r/min离心5min,收集乙腈层于另一50mL离心管中,再重复使用5mLAP的正己烷饱和的乙腈溶液溶液提取2次,合并3次提取液,待上样。(实验过程记得避光操作)

净化

小柱:C18  SPE 小柱500mg/6mL

活化:5ml甲醇

平衡:5ml乙腈

上样:全部待净化液 ,收集

洗脱:15ml乙腈:甲醇(2:1),收集

氮吹浓缩:全部上样液和洗脱液一起收集浓缩40度氮吹至干,加2ml乙腈定容,过0.22μm PTFE滤膜,上机分析。

平行样:每种前处理方法做一个基质空白,两个基质加标

可以发现,添加AP后,TBHQ回收率已达到90以上,而BHT虽然有提高,但是回收率依然达不到要求,因此还需要进行再次优化。

3  增加提取次数

BHT的回收率依然不好,又进行了一系列实验,比如氮吹不吹干等,发现回收率依然没有提高,在这种情况下,测了一下提取液的回收率,果然,BHT的回收率只有60,这可能是由于BHT易溶于油脂中,在液液萃取过程中不容易提取出来。因此,遵循少量多次的提取原则,将国标GB 5009.32-2016中的提取次数3次增加到了5次,发现BHT的回收率终于达到了80以上,最终确定的实验方案和实验数据如下。

基质   植物油

AP的正己烷饱和的乙腈溶液:1L正己烷饱和的乙腈中溶解0.1gL-抗坏血酸棕榈酸酯(AP)

准确称取混合均匀的试样1g(精确至0.01 g)于50mL离心管中,加入3mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品,涡旋1min,静置10min,用3mLAP的正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min3000r/min离心5min,收集乙腈层于另一50mL离心管中,再重复使用3mLAP的正己烷饱和的乙腈溶液提取4次,合并5次提取液,待上样。

净化

小柱:C18  SPE 小柱500mg/6mL

活化:5ml甲醇

平衡:5ml乙腈

上样:全部待净化液 ,收集

洗脱:15ml乙腈:甲醇(2:1),收集

全部上样液和洗脱液一起收集浓缩,在40下旋蒸至1ml左右,转移至15mL离心管中,用少量乙腈润洗旋蒸瓶3次,合并后40氮吹至0.5mL,用乙腈定至2mL,涡旋30s,过0.22um PVDFPTFE滤头后,用高效液相色谱仪配二极管阵列检测器测定。

平行样:一个基质空白,两个基质加标

仪器测定条件

仪器:HPLC-DAD

色谱柱:C184.6*100mm*2.6um

流动相梯度:

流速:1.0mL/min

柱温:35

进样量:10μL

检测器波长:280nm

实验谱图

1:50ppm标准谱图

2:植物油基质空白谱图

3:植物油基质加标50ppm

最后,总结一下,进行SPE操作回收率不好时,该怎么优化。最重要一步的就是分布收集,发现目标物损失的步骤,进行改善,如果回收率依然不好,就需要考虑提取的步骤,目标物的性质(是不是易降解)等,大家学会了吗?GB 5009.32-2016定食用油氧化剂前处理优化后的结果:用含AP的正己烷饱和的乙腈溶液提取,并重复提取4次,合并5次提取液净化C18柱时要全部上样液和洗脱液一起收集浓缩并注意整个实验过程要避光进行(用棕色的离心管,棕色的蒸瓶,棕色的液相样小这样各种抗氧化剂的回收率可达到90%上。




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针对回收率低做了不少实验,楼主是个有耐心的人。
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hujiangtao
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液相方法检测食用油中干扰抗氧化剂峰的杂质很多,需要很好的去除杂质干扰
zyl3367898
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文章条理清晰,图片清晰,数据齐全,做了不少试验。
zyl3367898
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提取次数由3次增加为5次,这样前处理的时间会增加多少?有什么 更好的优化方法?
m3316431
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伊瑶
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原文由m3316431(m3316431)发表:把AP加到已腈里面,这也是一个思路。
数据齐全,图文并茂,值得学习。
简爱
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