主题:【第十四届原创】外泌体蛋白质的提取

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体蛋白质的提取



1RIPA裂解液的配置:正常购买的裂解液中分别加入0.1%2%4%8%SDS,配置系列RIPA裂解液。

2)将提取的外体溶液加入等体积的蛋白裂解液在冰浴进行裂解。为了使其充分裂解,每5 min振荡一次,共裂解50 min。随后加入4×蛋白变性缓冲液100℃煮沸5 min,将变性的蛋白样品放入-20冰箱中保存备用。

蛋白浓度的测定

首先,将上述外体裂解后的蛋白原液于4℃以12000 rpm离心15 min,弃去沉淀。取15 μL上清液与45 μL PBS缓冲液混合(稀释4)配置蛋白稀释液。然后用PBS缓冲液稀释BSA标准蛋白溶液,配制终浓度为0 mg/mL0.025 mg/mL0.05 mg/mL0.1 mg/mL0.2 mg/mL0.3 mg /mL0.4 mg/mL0.5mg /mL的蛋白溶液。以A液:B=501的浓度配制工作液。最后,将上述配制好的标准蛋白和蛋白稀释液20 μL加入96孔板中,每孔加入200 μL工作液,设置3个复孔,吹打混匀,避免出现气泡。将锡箔纸覆盖的96孔板放入37℃恒温箱孵育30 min。酶标仪的检测波长设置为562 nm,检测各孔的OD值。根据酶标仪算出的标准蛋白拟合曲线计算蛋白原液的浓度。

Western blotting



110%分离胶的配置

将玻璃板清洗干净后组装起来,加入适当的三蒸水,20 min后,观察液面是否下降,来检查装置是否紧密。待玻璃板干燥后按比例配置分离胶:4 mL去离子水;3.3 mL 30%丙烯酰胺;2.5 mL pH=8.8 Tris-HCl100 μL 10 % SDS100 μL 10% APS4 μL TEMED。将分离胶混匀后加入玻璃板中,在该过程中应避免产生气泡,随后在玻璃板中加入适量的酒精压平界面,待30-40 min后,分离胶凝固,倒掉上层酒精。

2)基层胶的配置

待玻璃板干燥后加入配置好的基层胶(2.7 mL去离子水;670 μL 30% PAGE500 μL pH=6.8 Tris-HCl40 μL 10% SDS40 μL 10% APS4 μL TEMED),立刻插入梳子,避免产生气泡,等待基层胶凝固。

3电泳

清洗并组装电泳装置,固定SDS-PAGE凝胶,倒入配置好的1×电泳缓冲液14.4 g 甘氨酸,3 g Tris1 g SDS,加入去离子水,搅拌溶解,定容至1000 mL)。拔出梳子,用20 μL移液枪吹打每个加样孔以去除杂质,用40 V电压电泳20 min疏通每个泳道,关闭仪器。然后按照试验要求加入变性后的目的蛋白和蛋白Marker,样品的两边可以加入1×上样缓冲液进行补齐。打开仪器开关,将电压调至60 V进行电泳,当溴酚蓝到达基层胶和分离胶的连接处,将电压调整到90 V继续电泳,直至溴酚蓝跑到接近底部。电泳结束后,拆除装置,取出凝胶,切除多余的部分备用。如需考马斯亮蓝染色,将凝胶放入考马斯亮蓝染色液中,摇床振荡30 min后,用蒸馏水洗涤3次后放入洗脱液中进行洗脱。

4转膜

配置1×转膜缓冲液(14.4 g 甘氨酸,3 g Tris150 mL 甲醇,加入去离子水,搅拌溶解,定容至1000 mL)。将适当大小的PVDF膜放入甲醇中激活5 min,随后放入转膜液中。转膜夹白色面朝下放入转膜液中,然后放入泡沫层、3层滤纸、激活后的PVDF膜、切好的胶、三层滤纸和最后一个泡沫层。在上述过程中应保证每层均无气泡存在。将装置放入转膜槽中转膜液中可以加入小冰袋,防止转膜过程中温度过高。将装置放入冰盒,恒流200 mA进行转膜,转膜时间由目的蛋白的分子量所决定。

5封闭和免疫反应

转膜结束后,将膜和含5% BSATBST溶液放进封闭盒中,室温摇床慢摇2 h。随后TBST3次,每次10 min。配置适合比例的抗溶液,将膜放入其中,4℃摇床孵育过夜。第二天,TBST3次,每次10 min,在室温下摇床孵育二抗1 h,随后TBST3次,每次10 min

6显影

避光配置ECL发光液。将发光液滴加到膜上,避光孵育3 min,放入预冷后的发光板上,调整膜的位置,用BIO-RAD凝胶成像仪显影并拍照。

体的成功捕获进一步通过Western blotting进行验证。HSP70CD63TSG101CD81是四种典型的普遍存在的外体标记蛋白。通常这些蛋白在整个细胞上清裂解液中的表达水平极低。然而,通过所开发的Tim4@ILI-01免疫亲和材料富集后,这四种蛋白质均可以被显著识别(图3-7)。以上结果进一步表明所开发的Tim4@ILI-01免疫亲和材料可用于成功捕获外体。

1 培养基中外体特异性蛋白质HSP70CD63TSG101CD81Western blotting结果

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