超速离心法（UC）是目前外泌体分离的“金标准”，大约56%的实验人员使用这种技术分离外泌体。目前UC包括差速超速离心和密度梯度超速离心。差速超速离心分离外泌体的方法主要受颗粒的大小、密度和形状的影响，基于颗粒的沉降速率不同，通过施加离心力，样品可以根据它们的物理性质被分离。在相同的颗粒密度下，大颗粒的沉积速度比小颗粒快，因此，更小的颗粒，如外泌体，可以通过一系列连续增加的旋转速度分离出来，具体步骤如图所示。首先用300 g，2000 g，10000 g的转速分别去除培养基中的细胞、坏死细胞和细胞碎片，上清液继续进行100,000 g 70分钟的超速离心，沉淀部分重悬在磷酸盐（PBS）缓冲液中进行另一轮100,000 g超速离心，最后，将得到的外泌体重悬于PBS缓冲液中以作下一步分析。

密度梯度离心法将待测生物样品添加到自上而下密度逐步增大的溶液中，在超速离心之后，这些外泌体就会移动到对应密度梯度层的底部（外泌体的密度介于1.10-1.21 g/mL）。密度梯度离心法获得的外泌体具有更好的完整性和生物活性。此外，由于外泌体与胞外囊泡的大小存在重叠且外泌体存在异质性，差速超速离心分离得到的外泌体纯度和效率均较低，而密度梯度离心法使密度相对较低的外泌体漂浮，进一步净化了外泌体。