主题:【第十四届原创】超速离心法收集肿瘤细胞外泌体

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超速离心法收集肿瘤细胞外泌体



将之前冻存于-80℃冰箱中的人肺腺癌细胞H1299,人胃癌细胞MGC-803和人乳腺癌细胞MDA-MB-231放入复苏盒,37℃水浴锅融化,1500 rpm离心3 min。在超净操作台中,丢弃上清液,迅速加入4 mL新鲜培养基,将细胞悬液混匀转移到25 cm2的培养瓶中。倒置显微镜观察后放入375% CO2 恒温培养箱中培养。

细胞培养与传代



H1299重悬于含有10%v/vFBSRPMI-1640培养基中,恒温培养箱中培养。当达到90%汇合时,去除旧培养基,加入PBS缓冲液清洗两遍以去除部分死细胞和细胞碎片。弃上清后,加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液1 mL,在37℃条件下消化细胞2 min。通过倒置显微镜观察到细胞之间相互分离后,迅速加入2 mL新鲜培养基,轻轻吹打使培养皿上的细胞脱落1500 rpm离心3 min。去除上清液抽取适量细胞悬液加入新的培养皿中,补充适量培养基进去吹打混匀。放入培养箱中继续传代培养。MGC-803MDA-MB-231在含10%v/vFBSDMEM培养基中生长。其他操作与H1299细胞相同。

细胞冻存



配置冻存液FBS:DMSO=9:1,吹打混匀。取培养至覆盖培养皿表面90%的细胞,同传代步骤处理,离心后去除上清液,加入适量的冻存液后吹打均匀,转移至冻存管中密封,填写冻存信息,将冻存管放于冻存盒后转移至-80℃冰箱中备用。

培养基收集



细胞在无外泌体的培养基中生长至覆盖培养皿表面90%时,收集细胞培养上清。将上述培养基进行300 g10 min的离心,以去除死细胞;收集的上清液继续进行2000 g10 min的离心,用来去除细胞碎片;最后将上清液10000 g离心30 min,并用0.22 μm过滤器去除较大的细胞外囊泡,收集得到的溶液即为包含外泌体的培养基样品。

收集外泌体

首先,将培养基放入离心管进行严格配平,对称的两只离心管要精确到小数点后4位保持一致。将转子放入离心机时,要保证转子完全平衡。抽真空,慢慢将速度上升到100000 g进行70 min的离心。离心后弃上清加入PBS缓冲液,进行第二次100000 g70 min的离心。弃去上清液,将产物重悬于100 μL PBS缓冲液中,放入-80℃冰箱中保存。

外泌体的透射电镜表征



首先取10 μL外泌体溶液与等量的4%多聚甲醛混匀滴加到铜网上,过夜风干将其固定在铜栅格上。采用20 μL 2%磷钨酸溶液负染3-5 min,用滤纸吸取多余的染料,可在100 kV的透射电镜下观察外泌体的形貌。

首先采用TEM观察了所捕获外泌体的形貌。如图所示,可从TEM图片中清楚的看到膜泡结构,所捕获外泌体具有典型的圆杯状膜结构,与之前报告的外泌体形貌一致。

1 透射电镜表征外泌体的形貌。标准尺:500 nm



进一步通过NTA确定了捕获外泌体的大小和分布。如图2所示,所捕获外泌体平均大小为110.1 ± 1.0 nm。此外,从图中可看出所捕获外泌体呈单峰分布,表明捕获的外泌体具有高纯度。

2 NTA表征外泌体的尺寸



将细胞培养液、富集后的外泌体洗脱液、富集后的上清液和洗涤缓冲液(第一次洗涤和第二次洗涤)用SDS-PAGE进行分离。如图3所示,通过对比其他泳道,Tim4@ILI-01免疫亲和材料分离的外泌体样品中70 kDa处的大量污染蛋白含量明显降低。

3 SDS-PAGE分析从4 mL培养基中分离出的外泌体蛋白质(考马斯亮蓝染色)



对分离得到的外泌体进行表征。通过TEMNTA分析表明分离得到的外泌体的形貌和大小与文献报道一致。Western blotting实验结果表明,经富集后的细胞培养基中的外泌体标志性蛋白质HSP70CD63TSG101CD81的含量比富集前显著提高。
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