主题:【第十四届原创】Tim4@ILI-01免疫亲和材料收集外泌体

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Tim4@ILI-01免疫亲和材料收集外

称取8 mg Tim4@ILI-01免疫亲和材料,加入4 mL2 mM CaCl2的上述细胞培养上清液,在4℃条件下在摇床上振摇孵育2 h。将上述混合物于5500 rpm离心5 min,弃去上清,继续用1 mL的洗涤缓冲液20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.0005% Tween 20, 2 mM CaCl2)重复洗涤三次。继续加入100 μL EDTA洗脱液(20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA)与上述材料孵育15 min,离心后收集上清,即得外体。

捕获条件的优化

10 μL上述超离后外体样品作为标准品。在4条件下,取10 mg Tim4@ILI-01免疫亲和材料加入10 μL体标准品,分别孵育 30 min60 min90 min120 min180 minNTA法测试上清中外体的浓度,并寻找适的孵育时间。在此条件下,分别称取1 mg2 mg5 mg8 mg10 mg Tim4@ILI-01免疫亲和材料体标准品在4℃中孵育,利用NTA法测试上清中外体的浓度,并计算出最佳的材料用量

捕获效率优化

为寻找最佳的捕获条件我们对材料用量,孵育时间,捕获靶标和适用的细胞种类进行了优化。如图1A所示随着材料量从1.0 mg增加到8.0 mg,富集效率逐渐提高,达到最大值84.7±4.0%。进一步增加Tim4@ILI-01材料量,富集效率并没有提高反而略有降低。因此,我们选择8.0 mgTim4@ILI-01免疫亲和材料用于后续实验孵育时间对捕获效率的影响如图1 B所示。在其他条件保持一致的情况下,通过延长孵育时间,捕获效率可逐渐提高,并120 min内达到最大捕获率85.2±3.0%继续增加孵育时间不能进一步提高富集效率。因此,最终选择120 min作为最佳孵育时间

1 优化富集条件:Tim4@ILI-01免疫亲和材料用量(A)和孵育时间(B

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