主题:【分享】负峰(液相)

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我现在走一个反相色谱,流动相是pH2.5的磷酸盐缓冲液和20%的四氢呋喃,色谱柱:C18,检测器:PDA,检测波长:225nm,我在色谱图中出现负峰,位于第二个与第三个之间,我习惯于在色谱图刚开始的地方也就是V0 处出现负峰,但我从来没有在色谱中间出现负峰,你可以解释这是发生了什么吗?

也许最难的可以从最简单的原理开始:峰表示的是样品和流动相在不同的位置,峰是正是负,峰是否保留,都无关紧要。因此,我们需要做的是找到色谱图中额外的峰的来源,因为他才是我们知道负峰来源的有帮助的信息。


你说你已经习惯了在色谱图的刚开始的位置出现负峰,这些峰很大一个原因是样品基质与流动相在不同的位置出峰,这个可以用样品组成或者pH来解决,除非是用流动相溶解样品,异常(特别)峰一般来自这个不同,对于我们大多数不需要太关心这个,我们意识到这是样品溶解度与流动相之间的差别,有时候我们需要人为的创造这种差别,比如,样品在色谱柱上面富集。


这的确是正确的,通常我的样品有些额外的东西,比如说辅料等,然而他们会在早期洗脱出来,这里也是这样,同时,样品不是完全溶解在流动相里面,而是用流动相稀释。


挑出来说,如果额外的峰是辅料或者其他的其他,那么你就需要进对照,确定干扰峰来自辅料,那么你就需要去除。


我已经想到这个,我已经进对照甚至走流动相,干扰峰依然存在,


好的,这是一个重要的信息,如果你得到相同的现象而不是因为样品的原因,我们就可以排除样品的原因,因此我们需要关注仪器或者流动相本身。


如果你的干扰峰是正的,你可以考虑进样器,用过的注射器,样品瓶的密封件,或者与进样过程相关的东西是否受到污染,因为你的情况并非如此,我认为不是进样过程中污染了


流动相本身以及它接触到的所有组件是这个问题的最有可能原因,设想流动相中的一个成分以很低的浓度存在,并且在色谱在上面有保留,如果你进不含这种成分的流动相,并且得到的负峰的保留因子与进样品是一致的,这个叫做空位色谱法,为了解决这一问题,你需要找到这个物质,不幸的是,你的工作波长很低,你将会看到很多成分在低波长有更高的灵敏度,我相信这就是你刚开始选择这个波长的原因。


听起来你描述的就是我问题的症结所在,那我应该怎么做才能降低它或者更近一步消除它呢?


首先你需要检测流动相本身,四氢呋喃的质量怎么样?水的质量怎么样?你可以进一个用四氢呋喃溶的样品和用水溶解的样品,看他们是不是和负峰有相同的保留因子,如果出现相同的峰,那恭喜你,问题找到了。你可以一步步解决,如果在四氢呋喃中出峰,你可以检查四氢呋喃的质量和纯度,四氢呋喃易于产生过氧化物,四氢呋喃包含的一些东西是抑制过氧化物的产生,你可以从你溶剂瓶的标签上面得到信息,四氢呋喃也是塑料零件和从这些塑料中提起添加剂的优良溶剂,因此,任何与四氢呋喃接触的东西都是可疑的,过滤器,油管,密封件,套圈,等等


水也是可能的原因之一,大多数情况下,超纯水都是由Milli-Q?制水系统等的仪器制的,制水系统使用一段时间后需要更换相应的耗材。


另外一个来源是缓冲盐或者准备缓冲盐的过程中,在准备缓冲液的时候你用什么搅动你的烧杯?烧杯清洁过吗?你是用pH计测量pH吗?在使用之前你清洗过电极吗?


当你检查完流动相以及所能接触到的所有东西,但是发现问题依旧存在,我会再次认真的检查仪器细节,检查里面是不是有能和流动相发生反应的,特别是四氢呋喃?是不是仪器上面的小的细节都正确的清洗了呢?是不是管路里面长细菌了?我敢说我会把我的注意力放在溶剂,水,缓冲液的准备上面,并且仔细的检测。


听起来不错,但是这个的任务量也非常大,是不是有更简便的方法?


首先,我不明白为什么,其次,,你应该问自己一个问题,为什么你想要消除负峰,上面的描述感觉好像负峰并不会干扰分析,因此,你可能宣传这是一个生活常识,并且忽略它,当然如果你的实验室有严格的要求,那么这个你就需要仔细研判。



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