主题:【第十四届原创】超高效液相色谱-串联质谱检测动物源性食品中β-受体激动剂残留分析方法的优化

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hujiangtao
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农检联合队发表于:2021/09/20 12:01:42 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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超高效液相色谱-串联质谱检测动物源性食品中β-受体激动剂残留分析方法的优化

户江涛(黑龙江省农垦科学院测试化验中心)

摘要:对超高效液相色谱-串联质谱检测动物源性食品中β-受体激动剂残留分析方法进行了优化。试样经酶解,高氯酸、MCX柱净化后5β-受体激动剂在C18色谱柱上以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相,进行液相色谱分离,同位素内标法定量;质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式(MRM)。结果表明,5β-受体激动剂在0.5-25 ug/L范围内线性关系良好,相关系数(R)为0.9991-0.9996,定量限为0.5 ug/kg。在猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、鸡蛋空白样品添加浓度为0.5210 ug/kg 5β-受体激动剂的平均回收率为95.3%-108.7%,相对标准偏差(RSD)为3.27%-8.57%n=6)。本方法简便、灵敏、高效,适用于动物源性食品中β-受体激动剂含量检测

关键词:超高效液相色谱-串联质谱;动物源性食品;β-受体激动剂

β-受体激动剂是一种β-肾上腺素兴奋剂,主要用于治疗人、动物支气管哮喘挛等。在用于畜牧饲喂时意外发现有减少脂肪沉积,提高瘦肉率的作用,因此又被称为瘦肉精。由于β-受体激动剂化学结构稳定、半衰期较长,容易在动物组织中残留,长期食用含β-受体激动剂残留的食物可能会引起中毒,并对人体健康造成很大伤害。

我国农业部早在2002年就发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品目录》公告,禁止在食用动物饲养中使用克伦特罗等β-受体激动剂。虽然早已被禁,但瘦肉精事件仍然时有发生:2011年央视“3·15”晚会曝光了河南孟州等地养猪场采用瘦肉精饲养生猪,有毒猪肉流入济源双汇食品有限公司;然而十年后的2021年央视“3·15”晚会再次曝光了河北青县羊肉瘦肉精事件,动物源性食品安全问题再次受到各界广泛关注。

目前,动物源性食品中β-受体激动剂的检测方法主要有酶联免疫法、GC/MS法和LC-MS/MS法。酶联免疫法具有快速、灵敏度较高等优点,但存在较大的假阳性风险,一般仅作为初筛方法;GC/MS法灵敏度较低,且需要衍生化处理,操作步骤较繁琐。LC-MS/MS法特别适合β-受体激动剂这类难挥发、沸点较高的极性化合物检测,现已成为食品中该类兽药的主要检测手段。

我国动物源性食品中β-受体激动剂LC-MS/MS法的相关标准包括《GB/T 22286-2008》、《GB/T 21313-2007》、《农业部1025号公告-18-2008》等,这几个方法标准的前处理步骤都比较繁琐、耗时长(反复调节pH值、多次转移离心)、有机试剂消耗量大。本文通过大量实验研究,对上述方法标准前处理进行优化,建立了一种前处理步骤简便、灵敏度高、有机试剂用量少的快速、高效、准确检测动物源性食品中β-受体激动剂残留的UPLC-MS/MS法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂



Acquity UPLC超高效液相色谱仪Waters公司);XEVO TQ-MS三重四级杆质谱仪(Waters公司);高速冷冻离心机;氮吹仪涡旋混合器。

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、西马特罗、氯丙那林对照标准溶液及其相应同位素内标100 ug/mL,农业部农产品质量标准研究中心);β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(sigma公司);MCX混合型阳离子交换柱(60 mg/3 mLWaters公司);甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯,Fisher公司);高氯酸、氨水(优级纯,科密欧公司);实验用水为Millipore纯水仪制备。

1.2 标准溶液和乙酸铵缓冲液配置

1.2.1  5β-受体激动剂混合标准溶液(0.2 ug/mL)配置:分别准确吸取50 uL的上述5β-受体激动剂对照标准溶液(100 ug/mL)至25 mL容量瓶中。

1.2.2  5β-受体激动剂混合内标溶液(0.2 ug/mL)配置:分别准确吸取50 uL的上述5β-受体激动剂内标溶液(100 ug/mL)至25 mL容量瓶中。

1.2.3  乙酸铵缓冲液(0.2 moL/L):称取15.4g乙酸铵,溶解于1000 mL水中,用适量乙酸调pH5.2



1.3 样品前处理

1.3.1试样的酶解

准确称取2 g(精确到0.01g)测试样品于50 mL离心管内,加入0.2 ug/mL混合内标溶液(1.2.225 uL,涡旋混匀;然后加入0.2 moL/L乙酸铵溶液(1.2.35.0 mL,再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40μL,涡旋混匀,于37℃下避光振荡16 h

1.3.2 净化

酶解后放置至室温,10000 r/min高速离心5 min,上清液转移至50 mL离心管内,加入高氯酸100 uL,混匀后10000 r/min高速离心5 min,取全部上清液过MCX固相萃取柱(使用前依次用甲醇、水各3 mL活化)。待上清液全部过柱后,再依次用水、甲醇各3mL淋洗,抽干,用5%氨水甲醇溶液3 mL洗脱并收集,洗脱液在50℃下用氮气吹至近干。残余物用乙腈+0.1%甲酸溶液(1+9V/V1.0 mL溶解,涡旋混匀,过0.22 um有机系滤膜后供液相色谱串联质谱仪测定。

1.3 液相色谱及质谱条件

液相色谱:色谱柱:Waters BEH C181.7 μm50mm×2.1mm);柱温:30℃;流速:0.4 mL/min;进样量:2 μL;流动相A:乙腈;流动相B0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0~0.5min5% A0.5~3. 0 min3%~100% A3. 0 ~4. 0 min100%A4 ~4.1min100% A~5% A4.1 ~5.0min 5% A

质谱:离子源:电喷雾离子源正离子模式( ESI +) ;检测方式:多反应监测( MRM);毛细管电压:3.2 kV;离子源温度:150℃;去溶剂气温度:500℃;去溶剂气流量:1000 L /h;定性、定量离子对及碰撞能量见表1;色谱图见图1

1 5β-受体激动剂的质谱参数

化合物

锥孔电压/V

母离子/(m/z)

子离子/(m/z)

碰撞能量/V

克伦特罗

沙丁胺醇

莱克多巴胺

西玛特罗

氯丙那林

克伦特罗-D-9

沙丁胺醇-D-3

莱克多巴胺-D-3

西玛特罗-D-7

氯丙那林-D-7

25



23

25

20

25

22

24

27

23

21

277.1



 

    240.2

302.2



 

      220

 

      214

  286.1

  243.2

  305

  227

  221

203



259

148



222

164



107

160



202

196

153.8

204

151.2

167.2

167

203

15

10

18

10

15

28

18

9

12

17

15

18

16

18

13


﹡定量离子



[img]" style="max-width: 100%;max-height: 100%;[/img]

1 5β-受体激动剂标准溶液(5 ug/LMRM色谱图

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

目前,我国动物源性食品中β-受体激动剂检测相关标准的前处理步骤基本一致,以《农业部1025号公告-18-2008 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》为例:先对样品进行酶解,然后对酶解液用高氯酸调pH1.0(沉淀蛋白等杂质),离心后上清液再用 NaOH溶液调pH9.5(碱性条件下β-受体激动剂呈分子状态),再依次加入乙酸乙酯(15mL/叔丁基甲醚(10mL),合并有机相用氮气吹干,残渣用2%甲酸溶液5mL溶解后过MCX柱,洗脱氮吹定容离心后上机检测。

上述前处理过程需要两次调节pH、使用大量有机试剂,耗时长,且用有机试剂反提时容易造成目标物损失,影响回收率。β-受体激动剂呈弱碱性,在酸性环境中成离子状态,酶解液加入高氯酸离心后上清液呈酸性,直接过MCX柱可以减小后续有机试剂反提过程的损失,也更加经济环保。对同一阳性样品(克伦特罗),分别用本文1.3和《农业部1025号公告-18-2008》步骤进行处理,两种方式最终测定结果基本一致见表2。同时,本方法采用同位素内标可有效监测目标物前处理过程损失,尽可能消除基质效应的影响,使最终定量结果更加准确可靠。

2 克伦特罗阳性样品应用不同前处理方法的测定结果

前处理方式

平行1ug/kg

平行2ug/kg

平行3ug/kg

平均值ug/kg

RSD

%

本文1.3

6.33

6.75

6.58

6.55

3.2

农业部1025号公告-18-2008

6.26

6.38

6.77

6.47

4.1



2.2 线性范围和定量限

吸取一定量5β-受体激动剂混合标准溶液(1.2.1),0.1%甲酸+乙腈(1+9)溶液分别配置0.5151025 ug/L混合标准工作曲线以各自定量离子和相应同位素内标峰面积比值Y,其中A代表目标物定量离子峰面积,Ai代表该物质同位素内标峰面积)对应质量浓度Xug/L)做标准曲线,得到的线性方程和相关系数见表3结果表明,这5种物质在0.5~25 ug/L浓度范围内线性良好,相关系数R0.9991~0.9996之间。以10倍信噪比(S/N)计算,该方法5β-受体激动剂的定量限(LOQ)均为0.5 ug/kg

3 5β-受体激动剂标准溶液的线性方程、相关系数

化合物

线性范围/(ug/L)

线性方程

R

克伦特罗

沙丁胺醇

莱克多巴胺

西玛特罗

氯丙那林

0.5~25

0.5~25

0.5~25

0.5~25

0.5~25

Y=0.2217X+0.0078

Y=0.1878X+0.0065

Y=0.2523X+0.0106

Y=0.1986X+0.0033

Y=0.2164X+0.0057

0.9996

0.9994

0.9993

0.9991

0.9992





2.3 回收率和精密度

称取猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、鸡蛋空白试样2.0 g,分别添加0.5210 ug/kg水平的5β-受体激动剂混合标样,每个水平重复6次,按照1.3前处理方法处理后上机检测,实验结果见表4。结果表明,5β-受体激动剂在猪肉等5种空白基质中的平均回收率为95.3%-108.7%,相对标准偏差(RSD)为3.27%-8.57%n=6),均符合《GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》中关于准确度、精密度的相关要求。

4 不同基质中5β-受体激动剂克伦特罗加标回收率和相对标准偏差(n=6

基质

添加水平/(ug/kg)

平均回收率/%

RSD/%

猪肉







羊肉

猪肝

鸡蛋

0.5

2

10

0.5

2

10

0.5



2

10

0.5

2

10

0.5

2

10

106.3

103.5

98.6

101.7

104.3

100.4

99.3

103.8

102.7

96.1

98.1

95.6

106.4

103.8



104.6

6.37

5.33

4.67

5.27

4.49

4.34



6.69

5.17

4.47

8.57

6.44

5.32

7.77

6.41



5.30


化合物

基质

添加水平/(ug/kg)

平均回收率/%

RSD/%



克伦特罗

猪肉



0.5/2/10

106.3/103.5/98.6

6.37/5.33/4.67

牛肉

101.7/104.3/100.4

5.27/4.49/4.34

羊肉

99.3/103.8/102.7

6.69/5.17/4.47

猪肝

96.1/98.1/95.6

8.57/6.44/5.32

鸡蛋

106.4/103.8/104.6

7.77/6.41/5.30

 

猪肉

 

107.1/106.4/105.5

5.35/4.47/3.34

 

牛肉

 

106.6/103.0/104.6

6.67/3.27/4.40

沙丁胺醇

羊肉

0.5/2/10

105.3/108.1/101.1

5.51/4.62/5.67

 

猪肝

 

96.4/102.3/98.1

7.69/6.45/4.10

 

鸡蛋

 

106.0/103.8/104.3

6.69/6.11/5.93

 

猪肉

 

105.7/104.6/99.6

7.77/6.47/6.64

 

牛肉

 

104.7/106.9/103.4

6.51/5.23/4.46

莱克多巴胺

羊肉

0.5/2/10

108.7/101.3/104.3

7.43/5.37/4.46

 

猪肝

 

100.4/96.5/98.6

8.30/7.47/6.35

 

鸡蛋

 

107.7/104.0/105.5

5.83/6.44/4.61

 

猪肉

 

107.0/104.1/104.6

7.77/6.64/3.32

 

牛肉

 

106.4/108.1/103.3

6.43/5.57/4.43

西玛特罗

羊肉

0.5/2/10

107.4/105.1/106.0

5.45/6.71/4.33

 

猪肝

 

95.3/97.3/100.3

7.49/5.10/4.46

 

鸡蛋

 

107.1/108.3/101.8

7.30/6.54/4.42

 

猪肉

 

107.0/104.3/105.5

5.37/6.61/3.89

 

牛肉

 

103.4/107.0/102.8

6.64/6.39/3.87

氯丙那林

羊肉

0.5/2/10

106.4/105.1/103.9

6.34/4.49/5.55

 

猪肝

 

102.3/99.3/97.8

6.40/6.12/498

 

鸡蛋

 

106.3/104.1/106.6

6.98/5.63/5.78



3 结语

本文对超高效液相色谱-串联质谱检测动物源性食品中β-受体激动剂残留分析方法进行了优化。相较现行标准,该方法前处理步骤简单,减少了有机试剂的使用,更加经济环保;同时该方法灵敏度高,线性范围宽,具有较高的准确度和精密度,特别适合大批量样品的检测。

参考文献:

[1] GB/T 22286-2008 动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法.

[2] GB/T 21313-2007 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法.

[3] 农业部1025号公告-18-2008 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法.

[4] 农业部1031号公告-3-2008 猪肝和猪尿中β-受体激动剂残留检测 气相色谱-质谱法.

[5] DB22/T 1609-2012 动物尿液中β-受体激动剂测定 酶联免疫法.

[6] GBT 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测.
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这个前处理比较好,不用太多的有机试剂,步骤也简单,可以减少损失。
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加入同位素内标,可以消除基质效应,这个可以。
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