主题:【第十四届原创】离子色谱法测定药品中抗坏血酸含量

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离子色谱法测定药品中抗坏血酸含量

黄选忠

(湖北兴山县疾病预防控制中心,湖北兴山 443711)



摘要 建立离子色谱-抑制电导检测法测定抗坏血酸含量的新方法。以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱,以12.0 mmol/L NaHCO3溶液为淋洗液,流量为1.0 mL/min,柱温为30℃,采用等度洗脱的方式可将抗坏血酸与氟化物、氯化物、亚硝酸盐、溴化物、硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离,通过抑制电导检测,抗坏血酸的峰面积与其质量浓度在3.0~500.0mg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数r为0.9993,方法应用于维生素C针剂和片剂中抗坏血酸的含量测定,加标回收率为95.1%~101.6%,5次平行测定结果的相对标准偏差(RSD)为1.55%~2.79%,抗坏血酸的最低检出限为2.7mg/L,方法回收率较高、重现性良好,操作简便快速,可用于维生素C针剂和片剂中抗坏血酸的含量测定。

关键词 离子色谱法;维生素C含量测定

中图分类号:O652.63  文献标识码:      文章编号:

    抗坏血酸(AA,药品名为维生素C)是维持机体正常生理功能的重要的维生素之一,它广泛参与机体内多种氧化还原等复杂的代谢过程,具有重要的生理功能,包括促进胶原蛋白合成、加速伤口愈合、促进铁的吸收和叶酸的利用,增加造血功能等,在临床上主要用于治疗坏血病、特发性高铁血红蛋白血症、肝硬化、急性肝炎和化学中毒所至的肝损伤等,也可用于传染病及紫癜的辅助治疗,因此准确测定药品中抗坏血酸的含量对保障患者治疗效果具有重要意义。

目前测定抗坏血酸的主要方法有碘量法[1]、分光光度法[2-3]、电化学法[4]、高效液相色普法[5-7]、离子色谱法[8-10]等,其中,碘量法、分光光度法选择性差,电化学法、高效液相色普法需要专用仪器,离子色谱-电化学检测法[8]和离子色谱-间接荧光检测法[9]虽然有较高的检测灵敏度,但均需要专用检测器不便推广应用。离子色谱-电导检测法[10]线性范围为50~500mg/L,不适用于抗坏血酸含量在50mg/L以下的样品的检测。本实验研究用SH-AC-3型阴离子交换柱和CIC-100型色谱仪测定药品中抗坏血酸含量,结果表明,以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱、12.0mmol/LNaHCO3溶液为淋洗液,流量为1.0ml/min,采用等度洗脱的方式可使抗坏血酸与氟化物、乙酸盐、氯化物、亚硝酸盐、溴化物、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐等常见阴离子和苯甲酸、草酸等完全分离,且抗坏血酸的峰面积与其质量浓度在3.0~500.0mg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数r为0.9993,方法应用于维生素C针剂和片剂中等样品中抗坏血酸含量测定,加标回收率为95.1%~101.6%,5次平行测定的相对标准偏差(RSD)分别为1.55%~2.79%,按3倍信噪比(3N/b)计,抗坏血酸的最低检出限为2.7mg/L,方法适用于维生素C针剂和片剂中等样品中抗坏血酸含量测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

离子色谱仪:CIC-100,青岛盛瀚色谱公司。

抑制器:SHY-2型自再生抑制器,青岛盛瀚色谱公司。

定量环体积:25μL;

自动进样器:SHA—15型,青岛盛瀚色谱公司。

电子天平:万分之一,BT214D型,北京赛多利斯仪器系统有限公司。

电子天平:千分之一,JA2003型,上海菁海仪器有限公司

0.45μm滤膜过滤器:13 mm,青岛盛瀚色谱公司。

抗坏血酸(C6H8O6):分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

抗坏血酸标准溶液:1000mg/L,称取0.1000g抗坏血酸,溶解于高纯水,定容至100ml。

草酸(H2C2O4·2H2O):优级纯,国药集团化学试剂有限公司。

草酸标准溶液:1000 mg/L,称取0.1401g草酸(H2C2O4·2H2O),用高纯水溶解,定容至100mL。

磷酸二氢钾、溴化钾、 乙酸钠(CH3COONa·3H2O):分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

H2PO4-标准溶液:1000 mg/L,称取磷酸二氢钾(105℃烘烤2h)0.1402g用高纯水溶解,定容至100mL。

Br-标准溶液:1000 mg/L,准确称取溴化钾(105℃烘烤2h)0.1489g,高纯水溶解定容至100ml。

乙酸盐(AC-)标准溶液:1000 mg/L,称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O)0.2305g用高纯水溶解定容至100ml。

NO3-、F-、Cl-、SO42-、NO2-、苯甲酸标准溶液:均为1000 mg/L,编号分别为GBW(E)080223、GBW(E)080549、GBW(E)080268、GBW(E)080266、GBW(E)080264、GBW(E)100006,中国计量科学研究院。

碳酸氢钠:分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

实验所用其它试剂均为AR级。实验用水为高纯水(电阻率为18.2ΜΩ·cm)。

1.2 仪器工作条件

色谱分离柱:SH-AC-3型阴离子交换柱(250 mm×4.0 mm,青岛盛瀚色谱公司);保护柱:SH-AC-3型(50 mm×4.0 mm,青岛盛瀚色谱公司);淋洗液:12.0mmol/LNaHCO3溶液,流量为1.0ml/min;柱箱温度:30℃;电流:75mA;检测器:电导检测器;自动进样器:全定量环取样,取样后清洗(每针之间),置换量70μL,取样量25μL,扎针深度4mm。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

    抗坏血酸标准应用液:临用前将抗坏血酸标准溶液稀释成含抗坏血酸为100.0mg/L(A液)备用

抗坏血酸标准应用液(A液)0.30、0.50、1.00mL及抗坏血酸标准溶液原液(1000.0mg/L)0.30、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10只10mL容量瓶中加纯水至刻度,混匀,配制成抗坏血酸的质量浓度为3.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、200.0、300.0、400.0和500.0mg/L的系列标准工作溶液。

1.3.2标准曲线绘制

    取1.3.1制备的系列标准工作溶液,各管取1.5mL于样品瓶中,启动自动进样器进样,分别测定,以抗坏血酸的峰面积(y)为纵坐标,以色谱峰面积对应的抗坏血酸的质量浓度(x)为横坐标,绘制工作曲线。

1.3.3 样品处理

取维生素C片剂(标称值0.1g/片)10片用高纯水充分搅拌溶解后,定容至1000ml,滤去不溶物,取滤液经0.45μm滤膜过滤后供测试

吸取维生素C针剂(标称值0.5g/2ml)1.00ml用高纯水定容至100ml,取该样液经0.45μm滤膜过滤后供测试。

1.3.4样品测定

取上述样品测试液经适当稀释后于样品瓶中,启动自动进样器进样测定抗坏血酸的峰面积,以标准曲线法定量,同时进行加标回收试验。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 淋洗液的选择

在碱性条件下,抗坏血酸易发生降解反应生成草酸,影响抗坏血酸的准确测定,文献[11]曾报道在15.0mmol/LNaHCO3溶液(pH8.3)中抗坏血酸在80min内未降解为草酸,为尽量减少抗坏血酸的降解反应,试验选择pH值较低的NaHCO3溶液为淋洗液,并对NaHCO3溶液浓度进行了选择试验,结果见表1,从表1可见,NaHCO3

表1 NaHCO3溶液浓度选择试验结果(柱温30℃,流量1.0 mL/min)

组分

10.0mmol/L

12.mmol/L

15.0mmol/L

T/min

R

T/min

R

T/min

R

F-

5.702

3.96

5.463

3.72

4.972

3.28

抗坏血酸

8.431

3.34

7.938

3.17

7.045

2.88

Cl-

10.908

/

10.176

/

8.932

/



溶液浓度在10.0mmol/L~15.0mmol/L时,抗坏血酸均能与氟化物和氯化物完全分离,氟化物峰分离度分别为3.96、3.72和3.28,抗坏血酸的峰分离度分别为3.34、3.17和2.88,完全满足相邻组分完全分离R≥1.5的要求[12],故本试验选择12.0mmol/L的NaHCO3溶液为淋洗液,在此淋洗条件下抗坏血酸与氟化物和氯化物等常见阴离子的分离色谱图见图1。

图1 抗坏血酸与氟化物和氯化物分离色谱图



2.1.2 淋洗液流量的影响

考察了淋洗液流量分别为0.8、1.0、1.2 mL/min时各组分的分离情况,试验结果见表2,从表2可见,随着淋洗液流量的升高,各组分的保留时间(T)逐渐缩短,氟化物的峰分离度(R)逐渐降低,抗坏血酸的峰分离度(R)变化较小。在保证抗坏血酸与其他离子良好分离的前提下,以使组分有较短的保留时间和较高的峰分离度、系统有较低的压力,综合考虑,确定淋洗液流量为1.0mL/min。

表2  淋洗液流量的影响(12.0mmol/LNaHCO3溶液)

组分

0.8ml/min

1.0ml/min

1.2ml/min

T/min

R

T/min

R

T/min

R

F-

6.746

3.70

5.480

3.72

4.635

3.18

抗坏血酸

9.775

3.19

7.950

3.18

6.692

3.15

Cl-

12.473

/

10.163

/

8.571

/



2.1.3 柱箱温度的选择

试验了柱箱温度为25℃、30℃、35℃、40℃时各组分的分离效果,结果显示,随着柱温的升高,抗坏血酸的保留时间稍微延长,峰面积逐渐降低,峰分离度也逐渐降低,分别为3.25、3.17、2.95和2.81,这与邻苯二甲酸根[13]、草酸[14]、对氨基苯黄酸和巴比妥酸的试验结果正好相反,这是否与温度较高时抗坏血酸稳定性降低加速其降解有关,则有待进一步研究。考虑到较高温度时抗坏血酸更容易发生降解反应,同时便于柱温的控制,本试验选择较低的柱箱温度为30℃。

2.1.4 色谱柱的选择

12.0mmol/L的NaHCO3溶液为淋洗液、流量1.0 mL/min等度洗脱,考察了SH-AC-1型和SH-AC-3型阴离子交换柱对抗坏血酸与其他常见阴离子的分离效果。结果表明,SH-AC-1型阴离子交换柱虽然能将抗坏血酸与氟化物、氯化物等常见阴离子完全分离,但抗坏血酸的检测灵敏度明显偏低试验选择SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱。

2.2 共存物质的影响

    分别取1.1所列各种标准溶液配制成含抗坏血酸100mg/L,硝酸盐、亚硝酸盐各10mg/L,氯化物5mg/L,溴化物、苯甲酸、草酸各20mg/L,硫酸盐、乙酸盐、H2PO4-各40mg/L,氟化物2mg/L的混合标准溶液,取1.5mL于样品瓶中,启动自动进样器进样测定,以考察抗坏血酸与前述8种常见阴离子和2种有机酸的分离效果,结果表明,在本试验条件下,抗坏血酸与前述8种常见阴离子和2种有机酸可以完全分离,但H2PO4-、硫酸盐和草酸的保留时间分别长达55min、110min和152min多钟,其余组分的色谱图见图2,从图2可知,氟化物和乙酸盐的出峰顺序均在抗坏血酸之前其余8种组分的出峰顺序均在抗坏血酸之后,其中苯甲酸硝酸盐完全不能分离二者合并为一个峰,可见所考察的10种物质均不影响抗坏血酸的测定。

图2 抗坏血酸与常见阴离子色谱图



2.3 线性方程、线性范围与检出限

按照1.3.1配制标准系列,测定抗坏血酸的峰面积,抗坏血酸的峰面积(y)为纵坐标,以色谱峰面积对应的抗坏血酸的质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线,进行线性回归。测定仪器30min的基线噪声[15],以3倍基线噪声除以标准曲线的斜率(3N/b)计算抗坏血酸的最低检出限。其标准曲线的线性范围、线性方程、相关系数r(回归方程的截距、斜率和r均由仪器软件自动生成)、检出限如下:

线性范围:3.0~500.0mg/L,线性方程:y=11820x-52060,相关系数r为0.9993,检出限为2.7mg/L。

其中,50.0mg/L的抗坏血酸的色谱图见图3。

图3 50.0mg/L的抗坏血酸标准色谱图



2.4 样品测定及加标回收试验

按1.3.3、1.3.4的步骤操作,对维生素C针剂和片剂中抗坏血酸含量各平行测定5次,计算测定结果的相对标准偏差(RSD)。并在样中分别添加25.0、50.0、100.0mg/L的抗坏血酸测定方法的回收率,方法的加标回收率及测定结果的相对标准偏差(RSD)结果见表3。由表3可知,加标回收率在95.1%~101.6%,RSD为1.55%~2.79%,方法的回收率较高、重现性良好。其中维生素C针剂及加标样品色谱图见图4。

图4 维生素C针剂及加标样品色谱图

表3 样品测定及加标回收试验结果

样品名称

样品中抗坏血酸含量

本底值/(mg·L-1

加入量/(mg·L-1)

测得量/

(mg·L-1

回收率/%

RSD/%

维生素C针剂

0.498g/2ml

243.4、245.7、249.4、249.8、253.3

50.0

299.1

101.6

1.55

24.36、25.06、24.63、24.96、25.82

25.0

49.94

100.6

2.21

维生素C片剂

0.10g/片

103.0、102.7、99.91、98.33、96.53

100.0

195.2

95.1

2.79

24.91

25.0

48.96

96.2

/



3 结语

    建立了以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱,以12.0 mmol/L NaHCO3溶液为淋洗液,流量为1.0 mL/min等度洗脱,离子色谱-抑制电导检测法测定抗坏血酸的新方法。方法应用于维生素C针剂和片剂中抗坏血酸含量测定,加标回收率为95.1%~101.6%,5次平行测定结果的相对标准偏差(RSD)小于3%,抗坏血酸的最低检出限为2.7mg/L,方法回收率较高、重现性良好,操作简便快速,可用于维生素C针剂和片剂等样品中抗坏血酸含量测定。

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15)JJG823-2014 中华人民共和国国家计量检定规程 离子色谱仪
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