主题:【第十四届原创】气相分析方法开发经验分享

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气相分析方法开发经验分享(精华篇)

引言:方法开发是个复杂而又神秘的工程,往往需要扎实的理论知识储备,但同时也少不了经验的积累;对于方法开发,需要我们从多学科出发,分析仪器学、色谱学、药学、有机化学、分析化学等学科综合,也需要我们熟练掌握文献信息检索,从中吸取精华,同时不断去试错,下面就把我个人职业生涯的经验进行总结提炼,供同行一起学习探讨,有不足之处需要同行前辈予以指正。

一、确认主要工作内容

1.残留溶剂检测分析方法:GC-HS方法、GC直接进样方法

2.基因毒杂质检测分析方法

3.高沸点样品杂质分离与含量检测方法

二、信息收集

1.首先要确定待测物质的溶解性、极性、沸点,主要针对“溶剂残留”;

2.其次还需要确定样品的溶解性、热稳定性、极性、沸点、化学性质(酸碱)、物理属性(固体/液体/半固态)。

3.收集并计算化合物(待测物质)的CH含量比值%,CH含量%比值越高检测灵敏度就越好,反之,CH含量%比值越低检测灵敏度就越差。

三、色谱柱使用选择指南(分离关键)

序号

色谱柱型号

极性

使用范围

01

DB-624

弱极性

顶空/直接进样:残留溶剂(大部分)

02

DB-Wax(聚乙二醇)

强极性

低沸点物质分离,专属“醇类/有机酸”专用分析柱,极性物质峰型调节柱

03

DB-FFAP

(聚乙二醇酸改)

强极性

“有机酸/醛酮酚类”专用分析柱

04

CP-Volamine

中等极性

“胺类”专用分析柱,峰型调节柱

05

DB-1/HP-5

非极性

“非极性”专用柱,应用广泛

06

CP-Sil8 CB

弱极性

芳香族化合物的选择性较好,是用于方法开发的最佳色谱柱

07

DB-5MS

弱极性

GC-MS专用柱,高S/N及灵敏度,基毒研究

08

Cyclodex-B

中等极性

“手性分离”专用柱,良好峰型

09

HP-Chiral β

中等极性

“光学异构”专用柱,提高含N手性灵敏度

10

CP-Cyclodextrin-β-2,3,6-M-19

中等极性

异构通用柱



1.非极性色谱柱:分离主要根据沸点高低,沸点低先出,沸点高先出;同沸点的含有O含有N的极性先出,烃类后出,如:DB-1、HP-1、BP-1、SE-30;

2.极性色谱柱:分离主要根据分子极性大小,极性小先出,极性大后出,如DB-Wax;

3.首选中极性毛细管色谱柱,既能兼顾沸点差异又能兼顾极性差异,如:DB-624、HP-5;

4.色谱柱直径(内径/粒径)越窄/越小,柱效越高,峰展宽越小,峰越尖锐,峰灵敏度越高,增加分离度;

5.色谱柱膜厚影响传质阻力,液膜越薄的传质阻力越小,在同样的线速度下能够获得更高的柱效,柱效越高,峰展宽越小,峰越尖锐,峰灵敏度越高,增加分离度;液膜厚,保留时间延长

四、进样方法的选择

1.方法有:溶液直接进样法、顶空进样

残留溶剂-HS:大多数是低沸点物质(醇/酯/烷烃/醚),90%以上采用顶空进样(GC-HS),清洁进样,基本不出杂峰(溶剂),原料不被破坏但经济费用高。

残留溶剂-DS:5%及少数采用溶液直接进样(GC-DS),经济,但出杂峰多(主要原料破坏带入),易损坏色谱柱需清洁老化保护。

开发选择考虑总结:

序号

进样方法

开发方法考虑点

01

溶液直接进样

1)考虑样品热稳定性(进样口温度设置)

2)考虑样品与溶剂是否反应(质子/非质子溶剂)

3)样品是否水解及基质结合

02

顶空进样

1)考虑顶空条件建立

2)考虑待测物质与基质(溶剂)长时间加热


2.溶剂沸点过高(沸点大于180℃),且样品对热比较稳定首选溶液直接进样法;

3.溶剂沸点低(沸点小于150℃),且样品对热不稳定首选顶空进样法;

4.顶空进样法可消除因溶液直接进样会产生降解杂质峰而干扰目标峰(进样口温度大于200℃),采用顶空进样方法还可以减少对样品的预处理。

5.基因毒杂质方法开发,优先选择溶液直接进样法(限度低,主要考虑提高灵敏度);样品杂质分离选择使用溶液直接进样法。

6.对于基因毒杂质限度小于2ppm以下方法开发,优先选择GC-MS溶液直接进样法。

7.查看CH含量%比值选择进样方法:

CH含量%比值高:对于残留溶剂检测选择顶空进样法,对于杂质分离/控制或基因毒杂质控制选择溶液直接进样法时可开发低浓度供试品溶液。

CH含量%比值低:对于残留溶剂检测选择溶液直接进样法,对于杂质分离/控制或基因毒杂质控制选择溶液直接进样法时可开发高浓度供试品溶液。

五、确定定量方法

1.外标法:残留溶剂、含量(准确)

2.内标法:残留溶剂(主要针对易挥发烷烃类)

3.面积归一化法:样品杂质分离及纯度

六、样品预处理方法

1.气相色谱仪能直接分析的样品通常是气体或液体,固体样品在分析前应当溶解在适当的溶剂中,而且还要保证样品中不含GC不能分析的组分(如无机盐:进样口温度不能保证盐汽化),往往会聚集在进样口衬管或分流平板导致污染/堵塞,还有可能通过载气进入色谱柱中,损坏色谱柱的填料。

2.样品预处理/溶解原则:根据相似相溶原理。

3.样品分类:气体样品、液体样品、固体样品。

4.气体/液体样品预处理方法:

直接进样分析(纯度分析与检测),如:甲烷、乙醇;

脂溶性液体样品(杂质),通常需要用脂溶性有机溶剂溶解样品,如:甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、DMSO、DMF;

进样方式:溶液直接进样、顶空进样。

5.固体样品(含盐)样品预处理方法:

样品性质:易溶于水,难溶于有机溶剂,样品熔点高,难汽化,如:钠盐/钾盐/盐酸盐/硫酸盐/磷酸盐/富马酸盐;

如果选择水作溶剂-尽量使用顶空进样方法;

灵敏度不理想且限度低(1-10ppm)-可使用水溶解二氯甲烷/正己烷萃取法来进行预处理样品,这样既可以溶液直接进样又可以顶空进样,检测杂质/残留/基因毒通用。

6.固体样品(不含盐)样品预处理方法:根据相似相溶原理。

七、溶剂系统选择

1.如果是溶液直接进样法,优先考虑溶剂选择,溶解样品的溶剂和最大溶解限度;如果是顶空进样法,可根据样品和溶剂都能溶解;

2.原则上水溶性样品优先选择水,非水溶性样品可选择酯/醇、DMF、DMSO、NMP、DMAC;

3.溶液直接进样-样品溶剂选择考虑:

化学稳定(水解/醇解),优先选择水(水溶性)/醇/酯(脂溶性)作为溶剂;反之选择烷烃、质子溶剂(万能溶剂:DMF、DMSO、NMP、DMAC);

样品具有酸/碱性,但是检测残留溶剂或杂质也具备酸/碱性,可根据待测物质酸/碱性质选择酸碱中和样品;如盐酸/硫酸/富马酸盐等产品检测胺类,需要单独使用碱性溶剂进行中和解离,同样反之,如吡啶/钠/钾盐等产品检测酸类,需要单独使用酸性溶剂进行中和解离(具体溶剂选择,需要进行加标回收验证实验)。

供试品溶液要澄清,不与样品及待测物质反应或结合。

4.顶空进样-样品溶剂选择考虑:

化学稳定(水解/醇解),优先选择水(水溶性)作为溶剂;反之选择质子溶剂(万能溶剂:DMF、DMSO、NMP、DMAC);

样品具有酸/碱性,同上“3.”。

样品溶解完全没要求,顶空进样气体(溶剂残留)。

5.对于低限度燃烧值大的物质,可选用盐析溶剂系统,如:苯残留、三氯甲烷。

6.样品溶解溶剂选择,也要考虑残留溶剂的溶解度(如:烷、醚类不溶解水)。

7.大部分溶剂系统优先选择DMSO、NMP、DMF,因为既能溶解样品又能溶解溶剂。

八、柱温开发研究

1.等温:对于溶剂个数小(1-3个),且各溶剂沸点差异不算很大,此时可选择等温法,比如50℃保持10-15分钟(适合残留溶剂检测、基因毒杂质检测、含量测定);

2.程序升温:对于溶剂个数多(大于5个),且各溶剂沸点差异较大,此时可选择程序升温法,比如40℃保持10分钟,以10℃/min速率升至180℃,保持5分钟(适用于产品杂质分离、残留溶剂检测);

3.极端分离:对于大部分沸点低溶剂(当使用DB-624)且考虑分析时长时,可选用低温程序升温法,比如初始35-40℃(分析环境一定要保证<25℃);

4.经典程序升温(残留溶剂、杂质分离):

升温速率(℃/min)

温度(℃)

保持时间(min)

/

40

8或10

8或10

200

5

X

X

X

典型图谱

杂质分离

升温速率(℃/min)

温度(℃)

保持时间(min)

/

80

5

20

200

5

X

X

X



九、顶空条件方法选择和研究

1.炉温(加热-顶空瓶平衡温度):

以水为溶剂,温度选择范围75-90℃,最高选择90℃;

以DMSO、DMF等为溶剂,温度选择范围80-145℃,最高选择140℃;温度过高要考虑高温时长导致溶剂反应降解产生新的未知杂峰;

考虑温度过高有爆瓶危险,特别在使用盐析方法时(因为溶剂系统里水分存在)爆瓶概率增加;

加热温度研究最高温度一般低于溶剂10℃(在考虑灵敏度情况下)。

2.定量环温度:温度要大于炉温10℃;

3.传输线温度:温度要大于定量环温度10℃;

4.顶空瓶(加热)平衡时间:根据大部分溶剂沸点,沸点都相对高平衡时间就长,沸点相当都低平衡时间就短;常规平衡时间为30-60分钟,经典平衡时间为30分钟。

十、检测器选用

1.90%分析方法工作优先选用FID检测器:含碳氢化合物

2.基因毒杂质选用FID-MS检测器

3.如含电负性基团(F/Cl/Br)且含CH量少,选用ECD电子捕获检测器,如三氯甲烷无H物质

4.含有非碳氢化合物组分时,且对检测灵敏度要求不高,通常选择TCD检测器,主要气体检测,如辅材:氮气

5.其他:N/P(氮/磷)检测器

十一、方法建立

1.进样口温度:一般选择200-230℃,进样口温度要大于传输线温度,可根据样品性质研究选用中高温,如150-180℃(考虑样品不被热解);

2.检测器温度:一般230-260℃。检测器温度要大于进样口和色谱柱温度;

3.流速:3.0-5.0mL/min,经典流速为:4和5mL/min;

4.分流比:5:1-50:1;选择规则-响应值高大分流比,反之则小分流比;经典分流比为5:1(顶空进样)和50:1(溶液直接进样);

5.进样量:顶空进样-1mL,溶液直接进样-0.2-1uL,也可根据进样峰型进行改进;

6.样品浓度/配制开发研究:

顶空进样:0.2-1g(根据限度/灵敏度要求进行研究),对于大浓度要考察样品提取平衡;浓度一般控制在0.1-0.4g/mL(顶空装量控制在1-5mL);

溶液直接进样:一定要考虑溶解完全,浓度可根据限度/灵敏度要求进行开发研究;一般控制在0.5-200mg/mL;

开发研究合适的样品浓度,一定要根据杂质限度/灵敏度做相应研究调整。

7.对于杂质分离(溶液直接进样法),在方法开发同时也要考察残留问题,可增加清洗老化色谱柱方法程序,也可增加清洗进样针方法;还有对于对气相管路有吸附残留性质也可增加清洗程序(如胺类、>150℃高沸点物质),增加程序一定要作为分析方法的一部分,且一定要经过验证验收。

8.系统干扰考察研究:先走空白2针,样品1针、对照1针,查看空白、样品溶液的干扰情况,空白与样品应无干扰峰出现(方法验证-专属性),且对LOQ和LOD测试无干扰,基本能通过LOQ和LOD验证(方法好坏体现在系统与溶剂对测试的干扰);

9.最后进行100%加标回收测试,回收结果如果满足90%-105%,方法基本确定。

十二、分析方法评价与挑战

1.分析方法开发评价标准:

空白考察:空白溶液无干扰峰出现,应该对测试无影响(最小干扰<LOD);

分离度:最低分离度标准为,各相邻峰间分离度>2.0(最小1.5);

LOQ:确认灵敏度(响应值)最小的2个,将LOQ试验出来,LOQ对应浓度是否合格(LOQ含量不得高于限度的50%),且LOQ的S/N要大于10;

加标回收标准(90-110%);

溶液稳定性:100%加标溶液考察0、2、4、8、24小时的稳定性,主要考察峰面积RSD%(n=5)以及各溶剂的回收率%。

2.分析方法简单预实验(预验证):

线性:50%、100%、150%、200%(每点进2针),R大于0.999;

准确度:50%、100%、200%(每点进2针),回收率%应在90%-110%;

SST实验:6针对照结果,各溶剂峰峰面积RSD%(n=6)均小于6.0%;且考察各溶剂峰的拖尾因子或对称因子(0.9-1.1,最大不可超过2.0);

结语:干一行爱一行!冰冻三尺非一日之寒!需要我辈不断学习探究,从前辈哪里取经,不断将薪火传下去,不断扎实自己,并不断发扬光大我们药学神圣事业,为祖国的药学事业奋斗和奉献。
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原文由 zyl3367898(zyl3367898) 发表:
内容丰富,要不断学习探究。
是啊!要业精就要钻研
wazcq
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有几个疑问:1.对于低限度燃烧值大的物质,可选用盐析溶剂系统,如苯残留,三氯甲烷。 这个和燃烧值有什么关系?
                    2.方法建立里 流速3.0-5.0ml/min ;分流比5:1-50:1  这个是针对0.53mm毛细柱吧?
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原文由wazcq(wazcq)发表:有几个疑问:1.对于低限度燃烧值大的物质,可选用盐析溶剂系统,如苯残留,三氯甲烷。 这个和燃烧值有什么关系?
                    2.方法建立里 流速3.0-5.0ml/min ;分流比5:1-50:1  这个是针对0.53mm毛细柱吧?
1比热值大的(碳值)
2都可适用,做过对比
zyl3367898
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Ins_4e0d373f
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非极性色谱柱是不是沸点低先出,沸点高后出啊
m3336169
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原文由 Ins_4e0d373f(Ins_4e0d373f) 发表:
非极性色谱柱是不是沸点低先出,沸点高后出啊
绝大多数是的。但是也有例外
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原文由 Ins_4e0d373f(Ins_4e0d373f) 发表:
非极性色谱柱是不是沸点低先出,沸点高后出啊
绝大多数是的。但是也有例外
我感觉他可能想这么写,但是发错了
zyl3367898
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