水分测定之方法开发研究

一、引言

中国药典四部收载的水分测定方法，有5种分别为：卡尔费休法、烘干法、减压干燥法、甲苯法、气相色谱法；单就从检测成本与耗时经济性出发，其中卡尔费休法较烘干法、减压干燥法、甲苯法、气相色谱法等4种方法都要经济和检测周期快；同样在有明确的检测分析条件与参数，而卡尔费休法（容量法、库伦法）需要研究的项目都较后4种方法要多，所以此篇内容主要讲解卡尔费休法。

中国药典一部（中药）水分测定方法主要是烘干法、甲苯法；药典二部（化学药）水分测定方法主要是卡尔费休法。

卡尔费休方法开发主要内容：总框架、信息收集、容量与库伦比较、开发主内容。

二、确认主要工作内容

1.API水分检测方法：费休氏-容量滴定法、费休氏-库伦滴定法

2.中药材水分检测方法：烘干法、甲苯法

    3.制剂水分检测方法

三、信息收集

1.样品储存方式和样品分类

2.首先要确定待测物质的溶解性、理化性质、化学结构、稳定性；

①溶解性：这里的溶解性首先要考虑“脂溶性”，因为费休氏-容量滴定法、费休氏-库伦滴定法、气相色谱法3种方法都要样品溶解处理；

②理化性质：样品是否具有“引湿性或吸湿性”，样品熔点信息，pH值等；

③化学结构：具体指水分子在样品中存在形式，如：游离水、结晶水；另外还要确认样品化学结构是否含有其他特殊“醛/酮”结构。

④稳定性：具体指热稳定性，是否受热分解。

3.其次还需要确定样品中是否含有挥发性成分（主要是中药材）。

4.确认样品实际含水量，确认样品的经济价值，主要用来方法开发作依据。

四、KF容量法与KF库伦法溶剂组成对比（方法关键）

序号	溶剂名称	特点	说明
01	单组分 （容量滴定法）	1）组成：碘、二氧化硫、吡啶（咪唑）、无水甲醇，滴定剂。 2）关键点：价格低，处理简便，滴定度不稳定，滴定速度较慢；可加入助溶剂。	大部分（不含醛酮）； 含吡啶与不含吡啶组成 常量水分
02	双组分 （容量滴定法）	1）组成：A液-二氧化硫、吡啶的无水甲醇溶液，作为溶剂；B液-碘的无水甲醇溶液，作为滴定剂。 2）关键点：价格高，使用前按1：1在滴定杯中进行混合，滴定度稳定，滴定速度快。
03	醛酮专用	1）组成：碘、二氧化硫、吡啶（咪唑）、乙二醇甲醚，滴定剂。 2）关键点：只适合含醛酮结构样品。	专用试剂
04	阳极液 库伦滴定法	1）组成：碘、二氧化硫、有机碱（吡啶）。 2）关键点：反应快；不需标定，水分准确。	微量水§≤0.1%水 无水合物

1.含吡啶滴定剂优点：价格低廉及生产工艺简单而仍然广泛应用；含吡啶的卡尔费休试剂比不含吡啶的溶液较稳定，不容易分层，而且有些样品含吡啶的溶解效果会比较好；含吡啶的卡尔费休试剂有利于反应向正方向发生；含吡啶的卡尔-费休试剂终点的突变较明显，反应终点容易判断。

2.含醛酮结构样品：醛(R-CHO)和酮(R-CO-R)与通常的含甲醇试剂反应生成缩醛和缩酮，反应中产生的水同时被滴定，从而导致水分含量升高甚至终点消失。

3.正常卡尔费休反应的最大速率在5.5到8的pH范围之间，在实际操作过程中应避免pH值小于4 和大于8； pH大于8.5时，由于碘和氢氧根或甲基化离子之间的反应，反应速率会增大，但这将导致终点消失，并消耗更多的碘（滴定剂）。

五、检测方法的开发与研究

（1）主方法选择

1.主方法有：费休容量法、费休库伦法、干燥法、甲苯法

2.化学原料药及制剂/化学辅料：通常首选费休容量法，水分检测范围1%-100%，工作效率高检测结构准确度高。

3.中药材：通常首选干燥法（105℃干燥5小时，恒重5mg），耗时工作效率低。

4.含有挥发成分：首选甲苯法（只适合中药材）。

5.对于含微量水且对水分要求很高、且是无水合物产品，通常首选费休库伦法，水分检测范围0.001%-0.1%。

6.对于含有结合水/结晶水样品，优先选用费休法（容量法与库伦法）。

7.根据样品形态性质选用方法：固体样品优选容量法，液体和气体优选库伦法。

（2）KF滴定剂选择

1.滴定剂有：单组分（含吡啶）、双组分、醛酮专用、阳极液

2.库伦法测定水分首选阳极液。

3.分析样品结构式，如果样品含有醛酮结构，检测水分首选醛酮专用滴定剂。

4.一般常用水分检测用，对于含水量低（0.1%≤水分≤0.5%）、且检测准确度要求高，首选单组分（含吡啶）选用几率超过90%，其他一般可选用不含吡啶；其次选择双组分（详见对比表）。

（3）KF方法溶剂选择

1.溶剂开发原则：

①样品中含游离水，样品不需要完全溶解；样品含有结合水/结构水，样品需要溶解。

②溶剂不能影响样品水分检测，不能与样品有任何反应。

③如果样品不能溶解，可适当添加助溶剂，如甲酰胺、DMF

2.溶剂有：无水甲醇、无水乙醇、无水甲醇-甲酰胺/DMF

3.溶剂首选无水甲醇。

4.样品含有醛酮结构，检测水分首选无水乙醇作为溶剂。

5.对于不容易溶解的样品，可配置不同比例浓度的无水甲醇-甲酰胺首混合溶液，比例不要超过60：40（%，V/V），通过实验对比总结（主要是反应终点快慢），经典比例为无水甲醇-甲酰胺=70：35（%，V/V）。

6.对于样品pH偏高，会引起副反应发生，导致连续反应，而无终点出现或很难达到终点，此时应该加入少许苯甲酸或水杨酸，进行缓和中和一些高碱性环境（不能用乙酸）。

（4）KF方法仪器参数开发选择

1.转速：经典值200R/min

2.水分标定：

起始漂移值（检测前平衡）：20以下漂移值；

终点漂移值（结束）：15-50漂移值。

3.样品检测：

起始漂移值（检测前平衡）：30-50以下漂移值；

终点漂移值（结束）：25-60漂移值。

  4.对于样品检测很难达到终点，可将终点漂移值适当提高100。

（5）样品取样量及样品处理研究

1.对于含水量小于1.0%大于0.5%，样品取样量为0.2-0.5g；

2.对于含水量小于0.5%大于0.1%，样品取样量为0.5-1.0g；

3.对于含水量小于0.1%，样品取样量为1.0-2.0g；

4.对于样品经济价值高，可根据含水量酌情规定取样量30-50mg，且可根据实际测定情况选用库伦法进行验证或直接选用库伦法（例子：盐酸米托蒽醌）；

5.对于无水合物样品，可根据含水量酌情规定取样量1.0g-1.5g,如果产品属于高价值产品，可选择低取样量库伦法（例子：多西他赛、无水达沙替尼）。

6.由于样品化学性质导致其pH值不同，呈酸碱性，样品处理方法：

①对于酸性样品，样品导致溶剂pH值太低或过酸，可选择咪唑作为调节剂；

②对于碱性样品，样品导致溶剂pH值太高或过碱，可选择苯甲酸或水杨酸作为调节剂。

③在方法开发时就应该进行对样品+溶剂的pH值进行研究开发，维持系统pH6.5。

（6）样品溶解性研究与助溶剂筛选：

1.首先研究在甲醇中的溶解性（费休法溶剂90%以上都是首选无水甲醇系统）。

2.其次研究在水中的溶解性，主要研究其pKa值（也就是pH值），为确定其滴定系统最优pH环境（pH5.5~7.5）；在实际开发中是否需要添加缓和剂。

3.研究样品在乙二醇、甲酰胺、DMF、DMSO、二氯甲烷等助溶剂中的溶解性。

4.助溶剂使用量研究：以刚好溶解为好（能在1分钟内溶解为标准）。

5.样品吸湿性研究，为样品水分检测流程优化作依据：将溶剂先进行测量水分，再用溶剂进行溶解，将溶液进行一次性注射器转移储存测水分（一次性可以有效避开固体样品称量过程中水分干扰）总水-溶剂水。

（7）检测分析方法验证

1.专属性：选择1固定结合水样品进行水分检测，分别选用（库伦法、容量法）检查体系专属。

2.SST：使用纯化水20mg进行测定6次，计算其RSD%。

3.精密度：选择开发的样品（含有固定水分），重复检测6次，计算结果RSD%。

4.准确度：选择开发的样品，分别依次加入不同水分含量（25%、50%、100%），平行测定3次，计算测定结果RSD%。

六、结语

方法开发重难点主要体现在：容量法与库伦法选择、溶剂筛选、样品处理、相关计算以及分析方法验收标准；仪器的熟练使用以及检测数据异常分析（包括仪器故障排查与解决）对方法研究至关重要。