主题:【第十四届原创】动物源食品中五氯酚残留量的测定

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农检联合队发表于:2021/10/09 21:04:49 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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动物源食品中五氯酚残留量的测定



1 引言

五氯酚也称五氯苯酚(PCP)是一种重要的防腐剂,它能阻止真菌的生长、抑制细菌的腐蚀作用,长期以来均被用作皮革品和木材的防霉剂,对防治霉菌与一般 虫类(如白蚁)均有效。五氯酚酸钠盐(PCP-na)用于消灭血吸虫中间宿主钉螺和防治稗草等,由于其具有较高水溶性,溶于水扩散后对水源土壤造成污染,通过食物蓄积于动物体内,残留在食品中。

五氯酚酸钠降解缓慢,有致癌、致畸、致突变三致反应。长期食用五氯酚污染的食品可能对肝、肾及中枢神经系统造成损害。

2材料和方法

2.1仪器与设备  TSQ Quantis热电液相质谱仪;Milli-Q超纯水机(美国密理博);冷冻离心机(德国sigma);均质器(德国IKA);固相萃取装置。

2.2试剂与材料  五氯酚(厂家:坛墨质检;标准编号:91412IA;批号:902010;浓度200μg/mL)、甲醇、乙腈、甲酸(均为色谱纯,美国Thermo Fisher公司);实验材料:Copure(逗点)  MAX净化小柱(货号:COMAX360,批号:MO030447)

2.3色谱条件  色谱柱ZORBAX Eclipse C18 (3.0*150mm, 1.8μm);流动相:A:0.05%甲酸;B:乙腈梯度洗脱程序:0~1min,40%~75% B;1~7.5 min,75%~95%B;7.5~8min,95%~40% B;8~10min,40%B;流速:0.3mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10μL

2.4质谱条件 电喷雾负离子模式(ESI-);多反应监测扫描模式(MRM);条件如表1:

表1  五氯酚多反应监测条件

母离子

子离子

碰撞电压(Collision Energy)

262.7*262.7

0

264.7264.7

0

266.7266.7

0

268.7268.7

0



*表示定量离子

2.5标准工作曲线配制  将五氯酚液标(200μg/mL)配成20ug/mL标准贮备液,冷冻保存6个月;再将其用50%甲醇水溶液按逐级稀释成(1、2、4、8、10)ng/mL的标准系列工作使用液。

2.6样品溶液的制备 称取均质试样2 g(精确到0.01 g), 置于50 mL具螺旋盖聚丙烯离心管中, 加入6 mL 5%三乙胺的乙腈-水(70%)溶液。均质提取2min; 超声提取5 min后于6 000 r/min离心5 min, 收集上清液于一具刻度离心管中。 离心后的残渣用约6 mL 5%三乙胺的乙腈-水(70%)溶液重复上述提取步骤1次, 合并上清液, 混匀。净化:提取溶液转入经过预处理的MAX固相萃取柱(预先用使用前依次用5 mL甲醇和5 mL水活化)中, 以约1滴/秒流速使样品溶液全部通过固相萃取柱, 弃去流出液。 依次用5 mL 5%氨水溶液、 5 mL甲醇、 5mL 2 % 甲酸的甲醇-水溶液淋洗, 淋洗液完全通过小柱后, 弃去流出液, 用真空泵抽干固相萃取柱5 min以上。 以4 mL 8%甲酸甲醇溶液洗脱, 洗脱液用干净的15 mL具刻度试管收集, 40℃水浴下吹氮浓缩近干, 用50%甲醇水定容至2mL, 混匀。 溶液以0.22μm有机滤膜过滤, 供测定,上机测试。

2.7基质标准工作曲线的绘制 称取5份与试样基质相应的阴性样品2.0g, 分别加入20ng/mL五氯酚标液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL,按照2.6项下处理,最终得到1、2、4、8、10ng/mL相应基质的标准工作使用液。

3 结果与分析

3.1液相方法优化与典型图谱  GB 23200.92-2016的流动相:甲醇+5mmol/L乙酸铵溶液,梯度洗脱如下:

                  表2  GB 23200.92-2016 流动相梯度

时间(min)

流速(mL/min)5mmol/L乙酸铵溶液(%)

甲醇(%)

0.00

  0.3

60

40

1.00

  0.3

0

100

7.00

  0.3

0

100

7.50

  0.3

60

40

12.00

  0.3

60

40



在该流动相梯度下五氯酚于3.97min出峰,目标峰附近有干扰峰,其实际样品图谱见图1。

图1 按GB 23200.92-2016流动相为甲醇+5mmol/L乙酸铵液的鸡肉样品图谱

按2.3优化后的液相色谱条件进样分析,五氯酚于6.55min出峰,目标峰附近没有干扰峰,与基质干扰物实现了基线分离,其鸡肉样品的图谱如图2。

图2 按本文2.3流动相为0.05%甲酸+乙腈的鸡肉样品图谱

3.2 固相萃取小柱的选择和分布收集

在SPE操作过程中,分布收集是一种非常实用的实验技巧,分布收集就是通过收集上样液、淋洗液、洗脱液甚至进行二次洗脱,并上机分析,从而判断目标化合物具体损失的环节,明确实验步骤中具体需要优化的环节。根据以上讲述,按GB 23200.92-2016分别收集上样液、淋洗液、4%甲酸甲醇洗脱液、8%甲酸甲醇洗脱液,进行实验,得出实验数据,见表3

表3  MAX固相萃取小柱的分布收集回收率

项目

基质加标回收率(%)

MAX小柱基质加标上样-1

0

MAX 小柱基质加标上样-2

0

MAX小柱基质加标淋洗液-1

0

MAX 小柱基质加标淋洗液-2

0

MAX小柱基质加标4%甲酸甲醇洗脱-1

0.00

MAX小柱基质加标4%甲酸甲醇洗脱-2

0.00

MAX小柱基质加标8%甲酸甲醇洗脱-1

80.2

MAX小柱基质加标8%甲酸甲醇洗脱-2

82.4

MAX小柱净化吸附原理:五氯酚属于酸性化合物,其pKa接近5,在酸性条件下呈分子状态, 更易溶于有机溶剂, 在碱性条件下呈离子态, 更易溶于水,GB 23200.92-2016是采用5%三乙胺70%乙腈水溶液提取;该提取液中含有水分, 导致提取液中干扰物较多, 即使低温条件下高速离心后有些样品也有些浑浊。故需净化处理; MAX小柱:碱性条件上样,五氯酚离子化,被小柱吸附;酸性洗脱:五氯酚变回中性分子,失去与小柱间的作用力,被洗脱出来,因此不同品牌的MAX柱对五氯酚的保留能力不同,如果更换了不同品牌的MAX柱须对其做不同酸度的洗脱试验。从表2可以看出:将4%甲酸甲醇洗脱改成8%甲酸甲醇洗脱,可以将五氯酚目标物从MAX柱上洗脱下来,回收率从0提高到80%以上。



3.3溶剂效应和基质效应考查 GB 23200.92-2016标准采用的是空白样品基质匹配来配制工作曲线,本文考察了猪肉、鸡肉、淡水鱼、牛奶、猪肝等动物源性组织样品的基质效应情况, 具文献介绍, 基质效应ME=K1/K2,K1为基质匹配标准曲线斜率,K2为标准溶液曲线斜率,如果ME在(0.8~1.2)范围内时,基质效应不显著;如果ME大于1.2时,五氯酚信号响应在该样品基质为具有显著增强;如果ME小于1.2时,五氯酚信号响应在该样品基质为具有显著减弱;分别以各类不同样品基质阴性样品提取液为基质溶液作溶剂,以相应的基质提取溶液不同浓度为横坐标,其相应的响应信号为为纵坐标,绘制标准曲线。具体结果见表4。

表4  样品基质工作曲线回归方程、相关系数及基质效应ME

序号

样品基质提取液

工作曲线

相关系数

基质效应ME

基质效应

1

纯溶剂(50%甲醇水溶液)

y=3.335e4*x-5.445e3

0.9983

/

/

2

鸡肉基质

y=3.083e4*x+2.086e4

0.9940

3.083*e4/3.335*e4=0.9

不显著

3

鱼肉基质

y=4.2e4*x+2.415e3

0.9934

4.2*e4/3.335*e4=1.2

不显著

4

猪肝基质

y=3.0015e4*x-6.954e3

0.9994

3.0015*e4/3.335*e4=0.9

不显著

5

牛奶

y=5.564e4*x-4.426e4

0.9923

5.564*e4/3.335*e4=1.7

增强



除牛奶基质外,鸡肉、鱼肉、猪肝基质效应不显著,这也说明了采用Copure(逗点)的 MAX净化小柱有较好的净化效果,可以采用溶剂(50%甲醇水溶液)来绘制工作曲线。

3.4 方法学验证

3.4.1方法的回收率、精密度  取阴性空白鸡肉、猪肝样品基质分别做三个浓度水平(1.0ug/kg、2.0ug/kg、4.0ug/kg)加标回收实验,称取样品2.0克加入五氯酚标液(20ng/mL)(100uL、200uL、400uL)),理论上机浓度相应为1.0ng/mL、2.0ng/mL及4.0ng/mL。

样品加标回收率与方法精密度的实验数据(n=6)

序号



样品

基质

加标量(ug/kg)

回收率(%)

平均回收率

(%)

RSD

(%)

1

2

3

4

5

6

1

鸡肉

1.0

121.1132.794.887109.7110.1

109.2

15.3

2.0

84.3110.35109.583.976.4599.75

94

15.4

4.0

54.53 56.58 70.50 71.25 67.80 71.13

65.3

11.8

2

猪肝

1.0

107.9115.6124.1132.4134.8112

121.1

9.1

2.0

132.7123.9102.2106.2112.4104.9

113.7

10.7

4.0

80.582.694.981.081.586.5

84.5

6.6



3.4.2 方法的定量限  分别取空白基质鸡肉、猪肝样品2.0g,加水平为1.0ug/g(取20ng/mL五氯酚标准溶液100μL),按上述的样品前处理进行处理。注入液相色谱-串联质谱仪中,测定信噪比S/N≥10,实验结果符合标准要求

4定量限实验结果

项目

被测组分

上机液浓度

信噪比S/N

鸡肉基质

五氯酚

1ng/mL

259

猪肝基质

        五氯酚

1ng/mL

221

    


4 总结

    本文通过对GB 23200.92-2016标准从流动相的优化、固相萃取小柱MAX阴离子柱洗脱程序的优化、基质匹配工作曲线绘制的优化三大方面来检测动物源性食品中五氯酚的测定,并通过方法学的验证,满足检测的要求。

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好文章,改一下流动相,效果就很明显。
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测试回收率用不同比例的洗脱液,做的试验也很好。
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看来肉质的基质不强,牛奶的基质效应要强些,要用牛奶的空白基质配标线吗?
vm88
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试验过程很详细,基质与加标回收都做了。
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还以为肉质基质效应强,看来基质效应不强。
m3316431
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