主题:【第十四届原创】液相色谱-质谱/质谱法测定猪肉中四环素类兽药残留量

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SH104301
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仪信通会员战队发表于:2021/10/14 13:25:02 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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实验目的(实验背景及目的)

选取空白猪肉样品作为基质按不同添加水平进行试验,比对纳谱、B净化柱、A净化柱三种SPE小柱回收状况的准确度与精密度,为后续实验室HLB净化小柱的选择提供参考依据。



实验方法(前处理,标准品配置,色谱条件等):

1.SPE小柱


A净化柱

纳谱

B净化柱

货号

/

HLB060-030060-1

/

描述

HLB Pro

SelectCore HLB

Cleanert PEP-2 SPE

规格

60mg/3ml

60mg/3ml

60mg/3ml



2. 试剂与材料

除非另有说明,所有试剂均为优级纯,水为二级水。

2.1 甲醇:色谱纯。

2.2 乙酸乙酯:色谱纯。

2.3 甲酸:色谱纯。

2.4 柠檬酸溶液(0.1 mol/L:准确称取21.02 g柠檬酸,用水溶解,定容至1 L

2.5 磷酸氢二钠溶液(0.2 mol/L:准确称取28.41 g磷酸氢二钠,用水溶解,定容至1 L,混匀后备用。

2.6 Mellvaine 缓冲液:将1000 ml 柠檬酸溶液(0.1 mol/L)与625 ml磷酸氢二钠溶液(0.2 mol/L)混合,用氢氧化钠或盐酸调节PH=4.0±0.05

2.7 Na2EDTA-Mellvaine 缓冲液(0.1 mol/L):称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H20)放入1625 ml Mellvaine 缓冲液中,使其溶解,摇匀备用。

2.8 甲醇+水(1+19):量取5 ml甲醇与95 ml水混合。

2.9 甲醇+乙酸乙酯(1+9):量取10 ml甲醇与90 ml乙酸乙酯混合。

2.10 甲酸水溶液(0.1%):量取1 ml甲酸与1000 ml水混合。

2.11 标准物质:

物质

国家标准物质编号

浓度

标准物质来源

四环素

GSB05-3334-2016

100 μg/ml

农业部环境保护科研检测所

土霉素

GSB05-3333-2016

100 μg/ml

农业部环境保护科研检测所

金霉素

GSB05-3332-2016

100 μg/ml

农业部环境保护科研检测所

强力霉素

GSB05-3335-2016

100 μg/ml

农业部环境保护科研检测所



2.12 标准溶液

2.12.1 标准储备溶液:准确移取四环素、土霉素、金霉素、强力霉素各1ml,分别用甲醇定容至10 ml,储备液浓度分别为10 μg/ml,储备液在-18下贮存于棕色瓶中,可稳定3个月。 

2.12.2混合标准工作溶液:移取四种10 μg/ml的储备液各100 μL,用0.1%甲酸水定容至1 ml,配置成1 μg/ml的混合标准工作溶液;再依次配置成20 μg/L50 μg/L100 μg/L200 μg/L400 μg/L系列的混合标准工作溶液,混合标准工作溶液使用前配制。

3.样品前处理

    称取均质试验5 g(精确到0.01 g),置于50 ml聚丙烯离心管中,分别用约20 ml20 ml 0.1 mol/L EDTA-Mellvaine缓冲溶液冰水浴超声提取两次,每次涡混1 min,超声提取10 min4000 r/min离心5 min(温度低于15),合并上清液,并定容至50 ml,混匀,5000 r/min离心10 min(温度低于15),用快速滤纸过滤,取10 ml滤液待净化。

4.净化与仪器条件

目标化合物

四环素/土霉素/金霉素/强力霉素

样品基质

猪肉

样品基质中主要干扰物及其他成分

油脂和蛋白

分析方法

(参考标准)

GB/T 21317 动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法

液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法

具体操作步骤

溶剂

体积mL

流速

备注

活化

甲醇

5

自然流速

/

平衡

5

自然流速

/

上样

样液

10

自然流速

/

淋洗1

5

自然流速

/

淋洗2

甲醇+水(19+1

5

自然流速

/

洗脱

甲醇+乙酸乙酯(1+9

10

自然流速

/

之后

洗脱液40下,氮气吹至近干

其它

淋洗2完毕后,2.0 KPa以下减压抽干5 min

检测仪器

LC-MS/MS:赛默飞 TSQ Fortis

色谱条件

色谱柱

纳谱分析,ChromCore C18 2.1*100mm,3.0μm

柱温

30

流动相及梯度

A:0.1%甲酸水      B:甲醇

时间(min

A%

B%

1.0

80

20

4.8

5

95

5.7

5

95

6.0

80

20

进样量

5 μL

流速

0.35 ml/min

质谱条件

喷雾电压

3500 V(+)

鞘气压力

30 Arb

辅助气压力

4 Arb

蒸发温度

300

离子传输管温度

350



实验过程照片

图一:提取液待净化




图二:SPE小柱待活化




图三:SPE小柱洗脱


图四:0.1%甲酸水定容




图五:过膜


图六:上机分析




实验谱图

4种物质标准曲线图

Compound

RT

备注

四环素

2.98



同等浓度加标对比图中;
黑色---B净化柱;
蓝色---纳谱;
红色---A净化柱

土霉素

3.08

金霉素

2.72

强力霉素

4.17



空白基质TIC


试剂空白TIC




50 μg/kg-a




50 μg/kg-b





100 μg/kg-a



100 μg/kg-b



200 μg/kg-a



200 μg/kg-b






实验数据


SPE类型

化合物名称

加标浓度

平均回收率(%))

精密度(%

纳谱

四环素

50 μg/kg

123

2.4

100 μg/kg

116

4.6

200 μg/kg

118

1.8

土霉素

50 μg/kg

119

1.1

100 μg/kg

115

6.3

200 μg/kg

118

3.8

金霉素

50 μg/kg

98.8

4.6

100 μg/kg

98.0

5.6

200 μg/kg

92.4

2.2

强力霉素

50 μg/kg

88.7

3.8

100 μg/kg

80.2

4.5

200 μg/kg

104

0.46

B净化柱

四环素

50 μg/kg

80.2

8.2

100 μg/kg

85.6

10

200 μg/kg

86.4

5.2

土霉素

50 μg/kg

76.3

9.5

100 μg/kg

84.3

8.9

200 μg/kg

98.6

8.6

金霉素

50 μg/kg

70.2

10

100 μg/kg

81.3

7.8

200 μg/kg

74.6

7.9

强力霉素

50 μg/kg

72.7

1.2

100 μg/kg

80.6

4.1

200 μg/kg

82.3

2.6

A净化柱

四环素

50 μg/kg

117

5.6

100 μg/kg

97.2

5.8

200 μg/kg

114

3.6

土霉素

50 μg/kg

113

6.8

100 μg/kg

103

5.2

200 μg/kg

114

4.7

金霉素

50 μg/kg

96.9

6.5

100 μg/kg

94.5

6.3

200 μg/kg

88.4

4.6

强力霉素

50 μg/kg

88.8

4.2

100 μg/kg

82.5

1.2

200 μg/kg

103

2.3





结果分析

SPE小柱流速对比:纳谱>B净化柱>A净化柱。

纳谱回收率:80.2%-123%,平均值106%;精密度0.46%-6.3%,平均值3.4%

B净化柱回收率:70.2%-98.6%,平均值81.1%;精密度1.2%-10%,平均值7%

A净化柱回收率:82.5%-117%,平均值101%;精密度1.2%-6.8%,平均值4.7%



讨论

实验选取猪肉作为样品基质,四环素、土霉素、金霉素与强力霉素作为目标化合物,以常用国标GB/T 21317为实验依据,分别添加检出限浓度、限值浓度、二倍限值浓度进行平行实验分析,通过实验数据可知:

B净化小柱整体回收偏低;对于四环素与土霉素两种化合物而言,纳谱与A净化柱回收整体偏高(大于100%),而金霉素与强力霉素两种化合物回收较好,整体回收率而言,纳谱略好于A净化柱。

就实验数据精密度而言,纳谱与A净化柱均小于5%


结论

实验发现纳谱小柱回收率与精密度均很优秀,且小柱净化过程中的流速较快,节省时间。

最后,本文谨代表个人试验过程及体会,对于试验过程中的问题与不当之处,欢迎指出。



公司名称:山东华一检测有限公司

个人信息:郑××老师

地址:山东省高新区高新二路生物医药加速器4楼山东华一检测有限公司

色谱柱信息:

纳谱分析ChromCore C18 3μm, 2.1×100mm,序列号:21313-001034

纳谱分析SelectCore HLB 60mg/3ml



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