主题:【第十四届原创】S-腺苷-L-蛋氨酸的含量测定

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背景

腺苷蛋氨酸(SAM)是存在于人体所有组织和体液中的一种生理活性分子。它作为甲基供体(转甲基作用)和生理性巯基化合物(如半胱氨酸、牛磺酸、谷胱甘肽和辅酶 A 等)的前体(转硫基作用)参不体内重要的生化反应。在肝内,通过使质膜磷脂甲基化而调节肝脏细胞膜的流动性,而且通过转硫基反应可以促进解毒过程中硫化产物的合成。只要肝内腺苷蛋氨酸的生物利用度在正常范围内,这些反应就有助于防止肝内胆汁郁积。

S-腺苷-L-蛋氨酸 ,ATP的参与下甲硫氨酸经甲硫氨酸腺苷转移酶催化而成,在甲基转移酶的作用下,去掉一个甲基形成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),高效液相色谱(HPLC)适用于SAM的含量检测,依据其相应的色谱条件进样分析,进行含量测定。

实验材料与方法

1.样品预处理:


SAM标准曲线样品制备:将标准品32 mM SAM,用流动相逐级对半稀释成:0.25 mM , 0.5 mM , 1 mM , 2 mM ,4 mM (注意所有操作需在冰盒上操作,标准品SAM需涡旋仪混匀再使用,每个点稀释后也需混匀);标准品稀释完需离心取上清20 μl至样品瓶的带内衬管中,标记为标准曲线样品。

待检样品制备:将待检样品先离心取上清,以预估样品的理论含量,用流动相将样品稀释至1 mM,需做平行样对比(注意所有操作需在冰盒上操作,稀释过程也需混匀);取处理好的待检样品20 μl至样品瓶的带内衬管中,标记为样品。

标准样品:将标准品稀释至1 mM,同时做平行样品;取处理好的标准样品稀释液20μl至样品瓶的带内衬管中,标记为标准样品,验证方法和检测的可靠性。

2.仪器

液相色谱(waters-型号:E2695-2489

台式离心机(卢湘仪)-型号:TG16A-WS

移液器(艾本德) -型号:20-200 μl

电子天平(梅特勒)-型号:Five Easy Plus

3.色谱分析条件

仪器系统:waters 2695-2489

色谱柱:ChromCore 120 C18, 5μm 4.6*250mm

检测波长:260 nm

柱温:26±3

流速:1 ml/min

进样体积:10 μl

流动相: A液:5%甲醇(含0.1%冰醋酸)

洗脱方式:等度洗脱

洗脱时间:20 min



采用等度洗脱(需依据不同厂家的色谱柱自行优化)

时间(min

A%

B%

C%

D%

流速ml/min

最大压力限值psi

0

100

0

0

0

1.00

2500



实验图谱

0.25 mM SAM标准品(a


0.5 mM SAM标准品(b


SAM检测样品(c



注:以上为SAM标准品(a(b)和检测样品(c)色谱图



实验结论

将逐级稀释的标准品的各个含量,进样后得出其对应的峰面积,绘制成峰面积(y)与含量(x)标准曲线, 如以下图为,SAM标准品(0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM)峰面积与浓度含量的曲线图。如图所示,曲线 R2值应≥0.99,将SAM待测样品的峰面积带入到标准曲线里,得出相应的实际含量。





公司名称:苏州近岸蛋白质科技股份有限公司

个人信息:×老师

色谱柱信息:

纳谱分析ChromCore 120 C18 5μm, 4.6mm×250mm, 序列号:11538-002536
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