主题:【第十四届原创】基于《NYT939-2016》标准乳果糖含量测定的操作细则

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hujiangtao
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基于《NYT939-2016》标准乳果糖含量测定的操作细则



检测原理

牛奶仔加热处理过程中,部分乳糖结构异构为乳果糖,经β-D-半乳糖苷酶水解后生成半乳糖和果糖,通过酶法测定产生的果糖量计算牛乳中乳果糖含量。

2  试剂与材料

2.1  碳酸氢钠(NaHCO3

2.2  过氧化氢(H2O2),质量分数为30%

2.3  辛醇(C8H18O)

2.4  灭菌水

2.5  300g/L硫酸锌溶液

    称量534g ZnSO4·7H2O定容到1L水中

2.6  150g/L亚铁氰化钾溶液

  称量17.2g K4[Fe(CN)6]?3H2O定容到100ml水中

2.7  0.33mol/L氢氧化钠溶液(NaOH)

    称量3.3g氢氧化钠定容到250mL水中

2.8  3.2mol/L硫酸铵溶液

  称量42.28g (NH4)2?SO4定容到100ml水中

2.9  1mol/L氢氧化钠溶液(NaOH)

2.10 缓冲液A:pH=7.5

4.8g磷酸氢二钠(Na2HPO4,0.86g磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)和0.1g硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶解于80mL水中,用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH到7.5±0.1(20℃),稀释到100ml,摇匀。

(注:若是NaH2PO4·2H2O则称量0.972g)

2.11 缓冲液B: pH=7.6

    称取14.00g三乙醇胺[N(CH2CH2OH)3HCl]和0.25g硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶解于80ml水中。用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH到7.6±0.1(20℃),稀释到100ml,摇匀。

2.12 缓冲液C

40.0ml缓冲液B用水稀释到100ml,摇匀。

2.13 β-D-半乳糖苷酶悬浮液

3.2mol/L硫酸铵溶液将β-D-半乳糖苷酶制备成浓度为150U/100μl的悬浮液。

β-D-半乳糖苷酶酶活为8.9U/mg,则称量337㎎的β-D-半乳糖苷酶,用3.2mol/L硫酸铵溶液定容到2ml;若β-D-半乳糖苷酶酶活为10.3 U/mg,则称量292㎎的β-D-半乳糖苷酶,用3.2mol/L硫酸铵溶液定容到2ml。

2.14 葡萄糖氧化酶悬浮液

    用灭菌水将活性为200U/mg的葡萄糖氧化酶制备成浓度为20mg/ml(4000U/ml)悬浮溶液。

2.15 过氧化氢酶悬浮液

用灭菌水将活性为40000—60000U/mg(18mg protein/ml)的过氧化氢酶制备成15000U/ml的悬浮液。(要求15000U/样品管)

可以取1.2ml活性为40000—60000U/mg(18mg protein/ml)的过氧化氢酶定容到50ml灭菌水,每个样品管加1ml;或者直接向每个样品管中加入21μl的该过氧化氢酶。

2.16 己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液

    0.4ml浓度为3.2mol/L硫酸铵溶液中加入1mg活性为187U/mg或2mg活性为100U/mg的己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,轻摇均匀,成悬浮液。

2.17 磷酸葡萄糖异构酶悬浮液

2.18 ATP溶液

    50mg 5′-ATP-Na250mg碳酸氢钠溶于1ml水中。

2.19 NADP溶液

    10mgβ-NADP-Na2溶于1ml水中。



3  分析步骤

3.1 试液制备

    量取20.00ml样品和20.00ml水于锥形瓶中,混匀。

3.2 纯化

向锥形瓶中依次加入7.00ml亚铁氰化钾溶液、7.00ml硫酸锌溶液和26.0ml缓冲液A。每加入一种溶液后,充分振荡均匀。全部溶液加完后,静置10min,过滤,弃去最初的1ml-2ml滤液,收集滤液。

3.3 水解乳糖和乳果糖

慢速法:吸取5.00ml滤液于10ml容量瓶中,加入100μl的β-D-半乳糖苷酶悬浮液,混匀后加盖。在40℃水浴或干燥箱培养至少10h(10h—13h时间也不要太长)。

快速法:吸取5.00ml滤液于10ml容量瓶中,加入200μl的β-D-半乳糖苷酶悬浮液,混匀后加盖。在50℃培养1h。

3.4 葡萄糖氧化

依次加入2.0ml缓冲液C、100μl葡萄糖氧化酶悬浮液、3滴辛醇、0.5ml浓度为0.33mol/L氢氧化钠溶液、50μl过氧化氢和1ml过氧化氢酶悬浮液(或直接加入21μl活性为40000—60000U/mg(18mg protein/ml)的过氧化氢酶原液),每加入一种试剂均要摇匀。全部溶液加完后,在40℃水浴或干燥箱中培养3.5h。冷却后稀释至10ml,过滤,弃去最初的1ml—2ml滤液,收集滤液。

3.5 空白

依照2.1到2.4步骤处理空白溶液,但不加β-D-半乳糖苷酶悬浮液。

3.6 测定

 

测定步骤见下表。

步骤

空白

样品

比色皿中依次加入:

缓冲液B

ATP溶液

    NADP溶液

    滤液

    水


1.00ml

0.100ml

0.100ml

1.00ml

1.00ml



1.00ml

0.100ml

0.100ml

1.00ml

1.00ml



混合均匀后,静置3min (此步骤可省略)
加入己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液

20μl

20μl

混合均匀,等反应停止后(15min左右),记录吸光值

Ab1

As1

加入磷酸葡萄糖异构酶悬浮液

20μl

20μl

混合均匀,等反应停止后(25min左右),记录吸光值

Ab2

As2



注1:以上反应均在同一比色皿中完成。

注2:如果1ml滤液吸光值增加超过1.3,则减少样品滤液取样体积,注意增加水以保证比色皿中反应液总体积不变(3.24ml)。


4  结果计算

4.1 吸光值差

样品吸光值差△As的计算:

                      △As=(As2 - As1)

空白吸光值差△Ab的计算:

                      △Ab=(Ab2 - Ab1)

    样品净吸光值差△AL的计算:

                      △AL=△As - △Ab

4.2 乳果糖含量

乳果糖的含量以样品的质量浓度C计,数值以毫克每升(mg/L)表示,按下列公式计算:



C=△AL



式中:

    △AL——样品净吸光值差;

    ML ——乳果糖的摩尔质量(342.3g/mol);

        ——NADPH在340nm处的摩尔吸光值(6.3L·mmol-1·cm-1);

        V1 ——比色皿液体总体积,V1=3.240mL;

        V2 ——比色皿中滤液的体积,V2=1.00mL;

          d ——比色皿光通路长度,d=1.00㎝;

          V ——测试样体积(L)。

          计算结果精确到小数点后一位。

(注:代入数值后公式即为C=1408.32×△AL)

5  精密度

    在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。

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