（一）分离培养基的配制

1. 配制球菌分离计数培养基（Elliker）

胰蛋白胨20g，蔗糖5g，酵母提取物5g，NaCl 4g，明胶2.5g，乙酸钠1.5g，葡萄糖5g，抗坏血酸0.5g，乳糖5g，琼脂15g，水1L，pH6.8，121℃灭菌15min。

2. 配制杆菌分离计数培养基（酸化MRS）

蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母提取物5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二胺5g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，MgSO₄·7H₂O0.58g，MnSO₄·4H₂O0.25g，琼脂15g，水1L，pH5.4，121℃灭菌15min。

3.上诉培养基灭菌后倒平板待凝固。

（二）乳酸菌的分离与计数

1. 将市售酸奶用无菌水稀释至10^-7，分别取10^-6、10^-70.1mL涂布于Elliker酸化MRS培养基中，37℃培养48h。

2.对两种培养基中菌落进行计数，计算cfu/mL。

3. 取各培养基中菌落进行简单染色

制片——干燥——固定——草酸铵结晶紫染色2min——水洗——干燥——镜检，观察各培养基中菌落是否为相应球菌或杆菌。

酸乳中蛋白质、总糖含量检测与酸度检测



（一）酸乳的制备

全脂乳粉100g，蔗糖 80g，90-95℃灭菌5min，冷却后备用；或85℃，15min，冷却至44℃。将乳酸杆菌与乳酸球菌以一定比例接种（比例每组自拟），总接种量为3%，42℃发酵培养。定时测pH以及酸度，确定发酵终点。

（二）pH测定

将试样与标准溶液调到同一温度，记录测定温度，把仪器补偿旋钮调至该温度出，选用与水样pH相差不超过2个pH单位的标准溶液校准仪器。从第一个标准溶液中取出两个电极，彻底冲洗，并用滤纸吸干。在进入第二个标准溶液中，其pH约与前一个相差3个pH单位，如测定值与第二个标准溶液pH值之差大于0.1pH，就要检查仪器、电极或标准溶液是否有问题，当三者均无异常方可测定水样。

样品测定：先用水仔细冲洗两个电极，再用水样冲洗，然后将电极侵入水样中，小心搅拌摇动，带度数稳定后记录pH。

（三）酸度测定

称取10g试样，置于150mL锥形瓶中，加20mL新煮沸冷却至室温的水，混匀。用氢氧化钠标准溶液电位滴定至pH8.3为终点；或于溶解混匀的试样中加入2.0mL酚酞指示液，混匀红用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。并在30s内不褪色，记录消耗的氢氧化钠滴定溶液毫升数，试样汇总的酸度值以^。T表示

X：试样酸度

C：氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度（mol/L）

V：滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）

m：试样的质量（g）

0.1：酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度（mol/L）

（四）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

1. 标准蛋白溶液的配制：精确称取牛血清白蛋白100mg，用蒸馏水定容至100mL，配制成1.0mg/mol标准溶液。

2. 考马斯亮蓝G-250溶液配制：精确称取考马斯亮蓝G-250 100mg，溶于50mL95%乙醇，再加入120mL85%磷酸，稀释定容至1000mL。

3. 蛋白质标准曲线：取牛血清白蛋白标准液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加蒸馏水至1.0 mL，然后个试管中分别加入4.0 mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，室温下反应5min，OD595测定吸光度，绘制标准曲线。

4. 样品处理：取4mL发酵乳加入100mL蒸馏水中充分摇匀，从中取1 mL加40 mL蒸馏水制成待测液。

5. 样品测定：取1mL样品加入4.0 mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，室温下反应5min，以空白溶液做参比溶液，测定吸光度。根据标准曲线测定蛋白质含量。

（五）酸乳中总糖的测定

1.试剂配制：

（1）3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)：将6.3g的3，5-二硝基水杨酸和2molNaOH溶液加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中在室温放置7~10d后标定使用。

（2）mol/L的盐酸溶液。6mol/L的氢氧化钠溶液。
（3）葡萄糖标准溶液：
      将无水葡萄糖在105℃烘箱内干燥至恒重后配制成浓度为1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液；
2.总糖测定实验步骤

（1）葡萄糖标准曲线的制定

取1.0mg/mL葡萄糖标准溶液，按表Ⅰ加入试剂。沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25mL摇匀，在520nm波长测吸光度。



（2）酸乳中总糖的水解

取酸乳0.5mL置于50mL容量瓶中，加6mol/L的盐酸溶液2mL，在沸水浴中加热15min水解，冷水冷却后加6molL氢氧化钠溶液1.8mL，并定容至50mL，得总糖水解液。

（3）发酵液中总糖的测定

取总糖水解液2mL于25mL容量瓶中，加入DNS试剂1.5mL沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25mL摇匀，以空白作对照在520nm波长测吸光度。