主题：【分享】宿主细胞蛋白残留检测的重要性与必要性

一、研究背景

        当前生物制药管线，针对炎症、癌症和感染性病的治疗的主要药物形式是单抗药物。主要抗体药物靶点TNFα，VEGF/VEGFR，PD1/PDL1，HER2，IL12/IL23，IL17/IL17R等等。2019年市场规约1400亿美元，而且逐年递增。抗体药物由最初的鼠源抗体，到人鼠嵌合抗体，再到人源化和全人源化抗体发展，并衍生了Fab抗体、单域和单链等抗体形式。如今单抗也衍生出了创新型抗体药物如小分子抗体，抗体偶联药物，抗体融合蛋白，双特异性和多特异性抗体^[1]。

        常见的蛋白药物表达系统，有原核表达系统，如Escherichia coli ，E.coli；植物表达系统；真菌表达系统，如毕赤酵母，酿酒酵母；昆虫表达系统，如Spodoptera frugiperda cells，SF9昆虫细胞；哺乳动物细胞表达系统，如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO)，非洲绿猴肾细胞（African green monkey kidney cells，Vero）等。其中哺乳动物细胞表达系统，在临床药物的生产中，使用较为广泛。后续我们介绍了常见蛋白表达系统及其品系特点，蛋白纯化所用填料介质及其应用范围，以及蛋白纯化过程中需要重点关注的杂质残留，及其致病性或降低蛋白活性和稳定性的成分（含杂质残留检测方法的研究进展）。

        以CHO为例，CHO细胞产生的HCP，种类多样，复杂^[2]。仓鼠与人类有80%共同基因，CHO HCP和人内源蛋白有同源性，残留的HCP也会导致自身免疫反应，并引起与人自身蛋白的交叉反应^[3,4]。

二、法规要求

      在抗体药物表达后，随即进行培养上清收集等下游纯化操作。而下游操作的设计主要是宿主细胞总蛋白（Host cell protein, HCP）、核酸（质粒，宿主基因组，RNA），脂质，和产品相关杂质^[5]。最终产品的HCP水平<100ppm，残留DNA<10ng/剂，和<5%的高分子量的免疫总量^[6]。

三、宿主细胞总蛋白介绍

      宿主细胞总蛋白：对HCP的分析中，根据产物中HCP的作用，可以将之分为4类^[121]：

1）具有高生物活性的蛋白。其中的杂质，如CHO-K1分泌的转化生长因子β1对多类型细胞，都有很强的多重效应，并对人体细胞有诱导免疫的活性^[7]。

2）对产物蛋白或产物保护剂有分解作用的酶类。在大分子配方中，改善蛋白在生产，运输和储存中的稳定性^[8]。如吐温80受到磷脂酶切割分子脂键，分解成脂肪酸和醇，导致药物保护活力丧失。

3）对宿主有较强免疫原性的蛋白，具备佐剂效应，并会诱导炎症和免疫反应。诱导释放的细胞因子，并导致抗原呈递过程相关的细胞表面标志物的上调。

4）对机体或产物蛋白无作用，但是和产物蛋白能够共结合并纯化下来的一类蛋白。



四、HCP检测的经典方法介绍

      经典的HCP检测方法有双向电泳，蛋白质谱和酶联免疫吸附试验。且FDA规定，该三种方法要相互验证，以期能获得准确的检测结果。同时也有创新的方法引入，如液相色谱串联质谱（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS)和Immunoassay platform ELLA和Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA)等方法。目前，ELISA实验依赖于其优异的特异性，灵敏度和高通量，仍是HCP检测的金标准。同时结合LC-MS与2D方法结合验证。

   

赛唐生物基于ELISA方法，专注HCP产品领域研发10年，踏实做技术开发与制造。可以提供以下全流程专属性技术服务以及申请免费试用，详询QQ1045857940。

1、免疫与抗体制备

      动物免疫是蛋白抗原，借助包裹抗原溶液的免疫佐剂，将抗原递送到皮下，经过T help细胞将抗原呈递给B细胞，并形成浆细胞，分泌特异性抗体到血液中。将HCP蛋白抗原与佐剂充分混合，皮下免疫年轻雌性兔，五次免疫，各间隔两周后，酶联免疫吸附法检测血清效价，做加强免疫或动脉采血宰杀收集血清抗体。免疫后抗体效价可以达到10⁶-10⁷水平。抗血清量可达数十至数百毫升。



2、纯化与抗体标记

      动脉采血，4℃ 过夜后，离心取上清，即为抗血清。经过盐析，Protein A/G亲和层析，非IgG类蛋白流穿，IgG通过Fc端结合到Protein A结构域上，过量的结合缓冲液，平衡后低pH洗脱，有尖锐UV洗脱峰。收集洗脱液，并平衡至中性pH。 经过缓冲液置换，浓缩，Nanodrop One C UV以及Bradford法定量，并标记生物素或者辣根过氧化物酶，用于HCP的结合验证实验。



3、ELISA QC

标准曲线



LOD/LOQ



回收率



稳定性：

加速破坏实验显示，试剂盒4℃可储存一年。保质期可6个月。

 

样本检测

使用药物产物样本，和细胞上清样本，显示药物产物基本优于进口品牌，细胞培养上清优于进口品牌。注：鉴于细胞培养上清是赛唐生物提供，可以做第三方进一步对比。



参考文献：

[1] Chadd HE, Chamow SM. Therapeutic antibody expression technology[J]. Current Opinion In Biotechnology, 2001, 12(2): 188-194.

[2] Smales C M, Dinnis D M, Stansfield S M, et al. Comparative proteomic analysis of GS-NS0 murine myeloma cell lines with varying recombinant monoclonal antibody production rate[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 88(4):474-488.

[3] Gutiérrez AH, Moise L, De Groot AS. Of [hamsters] and men: A new perspective on host cell proteins[J]. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2012, 8(9):1172-1174

[4] Kanade Shinkai, Markus Mohrs & Richard M. Locksley. Helper T cells regulate type-2 innate immunity in vivo[J]. Nature, 2002, 420:825-829.

[5] USP：Guidance for Industry Q6B: Specifications

[6] 中国药典

[7] Beatson R, Sproviero D, Maher J, et al. Transforming growth factor-b1 is constitutively secreted by Chinese hamster ovary cells and is functional in human cells[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2011, 108(11):2759-2764.

[8] M. Hiraoka et al. Cloning and characterization of a lysosomal phospholipase A2, 1-O-acylceramide synthase[J]. J Biol Chem, 2002, 277(12):10090-9.