主题:【求助】要做免疫球蛋白的非还原性SDS-PAGE,有些事不明白。

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biotrandglobal
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要做免疫球蛋白的非还原性SDS-PAGE,需要注意什么?
1、想用6%的分离胶,4.2%的浓缩胶,是否可以?
2、样品处理缓冲液,与通常的还原性上样缓冲液不一样的就是不加DTT或巯基乙醇,对吗?
3、电泳时的电压是否要小些,以减少产热,但长时间电泳,是否会破坏胶(6%已经很软了)?
4、现在我用的丙烯酰胺的C值为3%(0.9g双叉丙烯酰胺加29.1g丙烯酰胺)是否合适,特别是对于这种低交联度的凝胶是否合适,是否要修改C值?
5、将来染色时能否用热的染色液,或者在微波炉中加热?(我们现在12%或15%的胶是在热的染色液中染色的。)
最佳答案:家有宝贝儿回复于2007/06/18

1、免役球蛋白的分子量一般为15万左右,选用6%的分离胶,4.2%的浓缩胶原则上是可行的,但是6%的分离胶在实际操作中太软,不好操作,尤其是剥离的时候一定要小心。
2、理解是对的。还原型和非还原型的区别就在于样品缓冲液,前者含有一定量的还原剂,常用的为DTT或巯基乙醇。
3、电泳时的电压小一点,对电泳是有利的,但是也是相对的。因为电压小电泳时间相对长,还是要产热。如果胶薄一些,如0.75MM的厚度,有利于散热。
4、C值为3%是常用的,不同的C值分离度不同,一般认为2.67%的分离效果最好。
5、用热的染色液染色能加快染色速度,但是一定要注意温度不要超过60度,一般如果时间允许,不建议采用加热的方法。尤其是要避免用微波炉加热,这个温度是很难控制的。
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原文由 biotrandglobal 发表:
要做免疫球蛋白的非还原性SDS-PAGE,需要注意什么?
1、想用6%的分离胶,4.2%的浓缩胶,是否可以?
2、样品处理缓冲液,与通常的还原性上样缓冲液不一样的就是不加DTT或巯基乙醇,对吗?
3、电泳时的电压是否要小些,以减少产热,但长时间电泳,是否会破坏胶(6%已经很软了)?
4、现在我用的丙烯酰胺的C值为3%(0.9g双叉丙烯酰胺加29.1g丙烯酰胺)是否合适,特别是对于这种低交联度的凝胶是否合适,是否要修改C值?
5、将来染色时能否用热的染色液,或者在微波炉中加热?(我们现在12%或15%的胶是在热的染色液中染色的。)

1、免役球蛋白的分子量一般为15万左右,选用6%的分离胶,4.2%的浓缩胶原则上是可行的,但是6%的分离胶在实际操作中太软,不好操作,尤其是剥离的时候一定要小心。
2、理解是对的。还原型和非还原型的区别就在于样品缓冲液,前者含有一定量的还原剂,常用的为DTT或巯基乙醇。
3、电泳时的电压小一点,对电泳是有利的,但是也是相对的。因为电压小电泳时间相对长,还是要产热。如果胶薄一些,如0.75MM的厚度,有利于散热。
4、C值为3%是常用的,不同的C值分离度不同,一般认为2.67%的分离效果最好。
5、用热的染色液染色能加快染色速度,但是一定要注意温度不要超过60度,一般如果时间允许,不建议采用加热的方法。尤其是要避免用微波炉加热,这个温度是很难控制的。
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谢谢斑竹的指导!

原文由 menghandna 发表:
4、C值为3%是常用的,不同的C值分离度不同,一般认为2.67%的分离效果最好。


有点不明白是为什么2.67%的C分离效果最佳。

再开帖吧,谢谢了。