主题：【第十九届原创】猴头菌素A、B、C提取与检测方法开发

猴头菌素A、B、C提取与检测方法开发

目的：建立猴头菇（Hericium erinaceus）菌丝体或子实体中猴头菌素A（Erinacine A）含量的高效液相色谱检测方法，确保检测结果的准确性、重复性和可靠性。

适用范围：本方法适用于猴头菇液态/固态发酵菌丝体、子实体粉末及相关提取物中Erinacine A、B、C的定量分析。

检测原理：样品醇类匀浆后经超声辅助提取后，采用反相高效液相色谱法分离。Erinacine A、B、C在C18色谱柱上基于疏水作用实现分离，紫外检测器在特定波长下采集信号，通过外标法定量。

名称	结构式
猴头菌多醇A/检测波长340nm
CAS号156101-08-5
中文名称：猴头菌多醇A 猴头菌素A
英文名称ErinacineA
分子式C25H36O6
分子量432.55

名称	结构式
猴头菌多醇B/检测波长230nm
CAS号:156101-10-9
中文名称：猴头菌多醇B 猴头菌素B
英文名:ErinacineB
分子式:C25H36O6
分子量:432.56

名称	结构式
猴头菌多醇C/检测波长210nm
CAS号:156101-09-6
中文名称：猴头菌多醇C 猴头菌素C
英文名:ErinacineC
分子式:C25H38O6
分子量:分子量:434.57

一、样品称取

       

图中15ml管内为冻干好的猴头液体发酵菌丝体



称取1g左右到50ml离心管中

 

1g左右菌丝体状态，密度较轻体积较大

 

称取完毕后准备每个离心管加入80%甲醇溶液25ml，料液比按照1:25，1g样品加入25ml溶液。

二、样品匀浆

               

加入25ml80%甲醇溶液后准备用手持匀浆机进行匀浆

               

使用时注意安全刀头一定拧紧，将离心管插入刀头，打开开关，调到5档最大档，试管上下移动，使样品与溶液充分混匀，一般匀浆2min左右

三、样品超声提取



匀浆完毕后放入超声机中，50度，超声60min



超声完毕后的状态

四、样品离心



用50ml离心管转子，离心机5000转离心5min，离心完毕后的状态

五、样品旋蒸浓缩



吸取10ml离心完毕后的上清液到旋蒸瓶中



将旋蒸瓶安装到旋转蒸发仪上，50摄氏度，200r/min，打开冷凝水，真空泵进行旋转，旋蒸至旋蒸瓶内液体进干状态。

             

六、样品过滤装瓶



向旋蒸至进干的旋蒸瓶加入5ml80%甲醇溶液，用吸管来回冲洗内壁几次，使其混匀。

               

过0.22um滤头到进样小瓶中

标准品配置

一、检查配置标准品ErA

     

此标准品瓶身标识重量2mg，这种小计量的用电子天平很难称取，所以联系厂家确认实际重量和标识重量是否一致，需要直接在瓶子里配置。第一遍确认为2mg，直接加2.0ml甲醇溶解后此为1000ug/ml的ErA母液，然后进一步稀释成500ug/ml，200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml，2ug/ml，1ug/ml。具体稀释方式为

500ug/ml从母液吸取500ul到进样小瓶中再加500ul80%甲醇溶液，此为500ug/ml

200ug/ml从母液吸取200ul到进样小瓶中再加800ul80%甲醇溶液，此为200ug/ml

100ug/ml从母液吸取100ul到进样小瓶中再加900ul80%甲醇溶液，此为100ug/ml

50ug/ml从500ug/ml吸取100ul到进样小瓶中再加900ul80%甲醇溶液，此为50ug/ml

20ug/ml从200ug/ml吸取100ul到进样小瓶中再加900ul80%甲醇溶液，此为20ug/ml

10ug/ml从100ug/ml吸取100ul到进样小瓶中再加900ul80%甲醇溶液，此为10ug/ml

5ug/ml从50ug/ml吸取100ul到进样小瓶中再加900ul80%甲醇溶液，此为5ug/ml

2ug/ml从20ug/ml吸取100ul到进样小瓶中再加900ul80%甲醇溶液，此为2ug/ml

1ug/ml从10ug/ml吸取100ul到进样小瓶中再加900ul80%甲醇溶液，此为1ug/ml

在配置完此标曲后厂家发来消息说跟技术确认了，实际重量在2.9mg，所以配成的实际浓度在1450ug/ml，根据换算第一次配置的ErA（A）标曲实际为括号中浓度500ug/ml（725）、200ug/ml（290）、100ug/ml（145）、50ug/ml（72.5）、20ug/ml（29）、10ug/ml（14.5）、5ug/ml（7.25）、2ug/ml（2.9）、1ug/ml（1.45）

根据实际浓度1450ug/ml配置成1000ug/ml，需要配置吸取690ml母液加310ml80%甲醇溶液配制出1000ug/ml标液，然后再更具上面讲的一次稀释。



配置完成9个点的标准曲线序列上机

2、 检查配置标准品ErB



ErB为250ug，但是注意瓶中的是液体，经与标液技术部门沟通此为250ug溶解在少量的乙腈中，纯度为99.2%，所以此处配置的时候要注意，要将瓶中的液体用移液器全部吸出到进样小瓶或1ml容量瓶中，然后用甲醇定容至1ml，此为250ug/ml的母液。

然后依次稀释配置成100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，10ug/ml，5ug/ml，2.5ug/ml的上机工作曲线。具体配置如下：

100ug/ml，从母液250ug/ml吸取400ul加到进样小瓶中，然后再加入600ul80%甲醇溶液。

50ug/ml，从母液250ug/ml吸取200ul加到进样小瓶中，然后再加入800ul80%甲醇溶液。

25ug/ml，从母液250ug/ml吸取100ul加到进样小瓶中，然后再加入900ul80%甲醇溶液。

10ug/ml，从100ug/ml吸取100ul加到进样小瓶中，然后再加入900ul80%甲醇溶液。

5ug/ml，从50ug/ml吸取100ul加到进样小瓶中，然后再加入900ul80%甲醇溶液。

2.5ug/ml，从25ug/ml吸取100ul加到进样小瓶中，然后再加入900ul80%甲醇溶液。



配置好的ErB标曲

三、检查配置ErC



ErC质量为500ug，往小品中加入1.0ml甲醇溶液

配置成500ug/ml。

然后依次按照步骤稀释配置成200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2ug/ml、1ug/ml。

200ug/ml，从母液500ug/ml吸取400ul到进样小瓶中然后再加600ul80%甲醇溶液。

100ug/ml，从母液500ug/ml吸取20ul到进样小瓶中然后再加800ul80%甲醇溶液。

50ug/ml，从母液500ug/ml吸取100ul到进样小瓶中然后再加900ul80%甲醇溶液。

20ug/ml，从母液200ug/ml吸取100ul到进样小瓶中然后再加900ul80%甲醇溶液。

10ug/ml，从母液100ug/ml吸取100ul到进样小瓶中然后再加900ul80%甲醇溶液。

5ug/ml，从母液50ug/ml吸取100ul到进样小瓶中然后再加900ul80%甲醇溶液。

2ug/ml，从母液20ug/ml吸取100ul到进样小瓶中然后再加900ul80%甲醇溶液。

1ug/ml，从母液10ug/ml吸取100ul到进样小瓶中然后再加900ul80%甲醇溶液。



配置好的ErC标曲

HPLC检测

一、仪器安捷伦液相1260InfinityⅡ

       

       

2、 色谱柱：赛默飞Syncronis C18 250*4.6*5μm

     

     

3、 仪器条件设置

1、四元泵流动相



2、 DAD检测器设置需要的检测波长



3、柱温箱设置30摄氏度



4、FLD检测器（荧光检测器）用不到按图例设置即可



5、RID检测器（示差检测器）用不到按照图例设置



6、进样器设置进样量20ul



7、 ErA标准品Era的出峰时间在23.9min左右



Era标准品1ppm谱图



Era标准品2ppm谱图



Era标准品5ppm谱图



Era标准品10ppm谱图



Era标准品20ppm谱图



Era标准品50ppm谱图



Era标准品100ppm谱图



Era标准品100ppm谱图



4号样品谱图



1号样品谱图



HBS14样品谱图



RT23样品谱图

8、 ErB标准品出峰时间25.653min，检测波长210/230nm都可以，230nm下基线更平稳一些



ErB2.5ppm谱图



ErB5ppm谱图



ErB10ppm谱图



ErB25ppm谱图



ErB50ppm谱图



ErB100ppm谱图

9、ErC标准品出峰时间25.941min，检测波长210nm



ErC1ppb标准谱图



ErC2ppb标准谱图



ErC5ppb标准谱图



ErC10ppb标准谱图



ErC20ppb标准谱图



ErC50ppb标准谱图



ErC100ppb标准谱图



ErC200ppb标准谱图

计算

根据称样质量m（g），提取体积（V），上机浓度C（ug/ml），根据计算出的上机浓度带入公式计算p（mg/g）



比如称取1.0025g样品（m），加入25ml（V）提取液，过膜后上机得出上机浓度C为24.56ug/ml

则计算p=24.56*25/1.0025*1000=0.612mg/g

假如有浓缩倍数，比如从25ml提取液吸取10ml，浓缩为2ml过滤膜上机，则有个浓缩倍数5则计算为（24.56*2/10）*25/1.0025*1000=0.122

4、 注意事项

在尝试以甲醇和水，乙腈和水两种流动相体系，在同时做ErA、ErB、ErC的情况下，甲醇体系优于乙腈体系，甲醇体系下出峰效果稍好与乙腈体系，在只做ErA的情况下可以选择乙腈体系，乙腈洗脱能力更强，出峰快于甲醇体系。甲醇体系下Era出峰时间在24min左右，乙腈体系在18min左右。