主题：【第十九届原创】高效液相色谱-测定抹茶中茶氨酸难点分析

高效液相色谱-测定抹茶中茶氨酸难点分析

张永梅

（重庆市计量质量检测研究院，重庆401123）

摘要:抹茶作为一种超微粉末状茶制品，其基质复杂度远高于普通茶叶。本研究参照GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》对抹茶样品进行分析时，发现存在明显的基质干扰，目标峰附近出现共洗脱杂质，影响定量准确性。针对这一问题，本文引入QuEChERS分散固相萃取净化步骤，对3批次抹茶样品进行加标实验。实验结果表明，3批次抹茶样品的加标回收率为102.3%~107.4%，RSD为1.7%~1.9%。本方法操作简便、成本低廉，可为抹茶及类似复杂基质中茶氨酸的检测提供参考。

关键词:抹茶；茶氨酸；高效液相色谱；基质干扰；QuEChERS净化

茶氨酸（L-Theanine）是茶叶中特有的非蛋白质氨基酸，也是抹茶鲜味品质的重要贡献成分。抹茶近年来因独特的风味和健康功效受到市场青睐，其茶氨酸含量已成为产品质量评价的重要指标之一。

目前茶氨酸的定量检测主要依据GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》^[1]。该标准采用热水提取后过滤直接进样的方式，对于普通茶叶基质能够基本满足检测需求。然而，抹茶与普通茶叶在物理形态上存在显著差异——抹茶粉末粒度极细，热水提取后形成高分散性悬浊体系，导致过滤极为困难，且易造成样品损失。与此同时，抹茶中富含叶绿素、多酚类、蛋白质及糖类等大量共提取物，这些基质成分可能与茶氨酸发生共洗脱，对色谱定量产生干扰。

针对茶叶中茶氨酸检测的前处理改进，国内外学者已进行了多方面探索。在提取环节，超声辅助提取、微波辅助提取等手段被用于缩短提取时间、提高提取效率；在净化环节，固相萃取（SPE）和分散固相萃取（QuEChERS）等技术被尝试用于去除茶叶提取液中的色素、多酚等干扰物。然而，上述研究多针对普通茶叶或茶饮料基质，专门针对抹茶这一特殊基质的前处理方法优化，目前尚未见系统报道。此外，QuEChERS方法在茶叶农残检测中已得到广泛应用，但其在抹茶茶氨酸检测中的适用性尚需进一步验证。

本研究以抹茶为研究对象，针对其基质复杂、过滤困难等问题，在GB/T 23193-2017的基础上引入QuEChERS分散固相萃取净化步骤，旨在建立一种简便、有效的抹茶中茶氨酸测定的前处理方法，为抹茶及其深加工产品的质量监控提供方法参考。

1实验部分

1.1仪器与试剂

岛津LC-20A液相色谱仪；电子天平（SQP/Quintix224-1CN，德国赛多利斯公司）；四川蜀科仪器有限公司TG-1850 高速离心机。

图1 实验仪器

乙腈（批号：D618978）色谱级，购于ANPEL Laboratory Technology（Shanghai) Inc；L-茶氨酸（批号：2569160；纯度99%）购于上海安谱璀世标准技术服务有限公司；QuEhERS净化管（批号：Y009618）购于北京振翔科技有限公司；0.22 μm微孔水系滤膜购于日本岛津有限公司；实验用水为超纯水。

样品：抹茶。

1.2 标准溶液的配制

本实验参照GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》配制茶氨酸标准溶液。

图2 GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》标液配制图

1.3 样品前处理

准确称取样品（（约1g，精确质量记为m（精确至0.0001g））于100mL离心管中，加沸蒸馏水至100mL。立即涡旋混匀10 min，以4000 r/min离心5 min，精密量取上清液10 mL，置预先装有分散固相萃取净化材料（无水硫酸镁900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷键合硅胶300 mg、硅胶300 mg、石墨化碳黑90 mg）的离心管中，涡旋混匀，置振荡器上剧烈振荡5 min，使净化完全，再以4000 r/min离心5 min，取上清液，经0.22 μm水相微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.4仪器条件

色谱柱：ZORBAX SB-Aq(4.6x250mm 5μm)；柱温：35℃；进样量：10μL；流动相流速：1.0mL/min；流动相A：100%超纯水；流动相B：100%乙腈；梯度洗脱程序：0-5.0min：0%B，5.0-6.0min:0%-80%B，6.0-14.0min: 80%B，14.0-15.0 min：80%-0%B，15.0-33.0min:0%B；检测波长：210nm。

1.5 计算公式

本实验参照GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》计算样品中茶氨酸含量。

图3 GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》茶氨酸含量计算图

2 结果与讨论

2.1 标液稳定性问题

标准GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》规定茶氨酸标准储备液可保存1年，但该条件可能不适用于日常分析所用的标准使用液，且标准中未注明具体的保存条件（温度、pH值等），这给实际操作带来不确定性。

我们在实验中将配制好的标准使用液在相同条件下分别于第0天（临用现配）和第5天进行测定，结果显示5天后的色谱响应值仅为现配值的50%左右，差异显著。这与文献报道^[2]的茶氨酸在特定条件下稳定性良好（将溶液煮沸5 min，或将其溶于pH 3.0溶液中并于25 ℃下储放12个月，含量无明显变化）的现象存在明显矛盾。

该现象可能与实验室超纯水的pH值有关。因此，在实际实验过程中，为确保定量结果的准确性，建议参考文献中的保存条件进行保存，同时需定期核查储备液的准确性。

2.2色谱柱选择问题

GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》规定的色谱柱和色谱条件如下：

图4 GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》色谱条件图

参照标准中推荐的色谱柱，由于实验室不具备相同型号，故参考文献^[2]选用ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色谱柱对茶氨酸进行分离。实验结果表明，茶氨酸在该色谱柱上可实现有效分离，出峰时间为3.8 min，此时流动相的水相比例为100%。

茶氨酸易溶于水，属于强极性化合物，在传统反相色谱体系中几乎无保留。研究表明^[3]，HILIC模式是分离此类强极性化合物的主流推荐方法。若实验室在紧急情况下不具备HILIC色谱柱，可参考选用ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色谱柱作为替代方案进行分离，方法在基质中的适用性需进一步验证。

2.3前处理方法问题

GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》规定的样品制备方法如下：

图5 GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》前处理图

按照标准所给前处理方法处理样品后上机测定，结果如6所示。将样品图谱与标准品图谱进行比对，可见样品中存在明显的基质干扰，且干扰峰与标准品的出峰时间十分接近。根据上述仪器条件，茶氨酸出峰时流动相已为100%水相，仪器条件已无法进一步优化，因此只能从样品前处理方法入手进行改进。

图6 GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》前处理后抹茶样品图

通过对比样品与标准品的峰纯度图可知，样品峰的纯度图谱存在明显差异，表明样品中存在基质共流出物的干扰。

图7 标准方法前处理样品和标准品峰纯度图

同时，按照标准前处理方法进行实验时，我们发现了一个实际问题：样品基质为抹茶粉末，在过滤环节明显比标准适用基质（普通茶叶）更为困难，滤速缓慢，易造成部分样品损失，进而可能影响回收率和测定结果的准确性。针对这一情况，需首先明确茶氨酸的提取原理，进而基于其理化性质对前处理条件进行针对性优化。

图8 GB/T 23193-2017《茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法》茶氨酸提取原理图

首先是样品的提取需在热水条件下进行，热水可加速茶氨酸的溶出。参考文献^[4]，热水提取茶氨酸的最佳工艺条件为提取温度98.55°C、提取时间40.97min、液料比12.61:1(mL/g)。

2.3.1前处理提取时间的优化

参考标准方法，本研究采用液料比为100:1（mL/g），以大量溶剂加速茶氨酸的溶出。加入热水后立即涡旋振荡提取，分别考察提取时间为5、10、15、20 min时茶氨酸峰面积的变化，以确定最佳提取时间。结果显示（图9），提取10 min后茶氨酸峰面积无明显变化，表明10 min时茶氨酸已提取完全，因此后续实验均采用提取时间为10 min。

图9 茶氨酸提取时间优化图

2.3.2前处理的选择

通过对抹茶样品的分析，发现提取液中可能存在多酚类物质、蛋白质与糖类、生物碱、色素等基质干扰。常见的去除方式包括液液萃取、QuEChERS净化及固相萃取（SPE）。考虑到SPE成本较高且操作耗时，本研究首先尝试采用液液萃取和QuEChERS净化两种方式去除干扰物。实验结果表明（图10-图13），液液萃取无法有效消除茶氨酸色谱峰附近的基质干扰，而QuEChERS净化能够显著改善该处的干扰情况。因此，本实验在热水提取后，进一步采用QuEChERS净化管对提取液进行净化处理。

图10 按标准处理茶氨酸图

图11 液液萃取效果图

图12 QuEhERS净化管净化效果图

图13 3种前处理方法对比图

2.3.3 通过色谱图评价基质去除效果

QuEChERS对抹茶提取液的净化效果如图14所示。与净化前相比，样品经QuEChERS净化后：在10 min附近的明显干扰峰被有效去除；茶氨酸目标峰周围基线明显改善，原共洗脱干扰峰消失；在3 min左右新增一色谱峰，该峰来源于净化材料，出峰时间远离茶氨酸，不影响其准确定量。结果表明，QuEChERS净化可有效消除抹茶基质对茶氨酸测定的干扰。

图14 QuEhERS净化管样品净化图

2.3.4通过峰纯度评价基质去除效果

QuEChERS对抹茶提取液的净化效果通过峰纯度对比结果如图15所示。图中右边黑色为样品的峰纯度，粉红色为峰。结果显示，结果显示，净化前样品峰的纯度图谱与标准品存在明显差异，表明该色谱峰受到基质共洗脱物的干扰；样品经QuEChERS净化后，其峰纯度图谱与标准品匹配良好，表明干扰已被有效去除。综上，QuEChERS净化可有效消除抹茶基质对茶氨酸测定的干扰。

图15 不同前处理方法峰纯度图

2.4线性和定量限

根据“1.2节”配制定量限溶液。然后按1.4节仪器条件“1.2节”的系列标准工作溶液和定量限溶液进行测试，记录峰面积，以茶氨酸的峰面积(y)对浓度(x，mg/L)，进行线性回归。以茶氨酸的信噪比评价定量限（S/N≥10），然后根据1.5节计算公式得到对应的方法定量限（表1）。线性关系和定量限结果显示，茶氨酸的线性相关系数不低于0.999999，定量限为0.3 g/kg，线性图见图14。

图16 茶氨酸线性图

2.5准确度和重复性

文献表明^[4]，茶叶中游离氨基酸总量为1%~2%，其中L-茶氨酸占游离氨基酸总量的50%以上，即茶氨酸的含量在0.5% ~ 2%（5 g/kg ~ 20 g/kg）。然而，抹茶中的茶氨酸含量通常高于普通茶叶，为避免检测信号超出标准曲线线性范围，本实验将QuEChERS净化后的样品溶液稀释2倍后上机测定。按“1.3节”所述前处理方法，在3个抹茶样品中分别添加5 mL茶氨酸对照品溶液（1000mg/L），每个样品平行实验6份，同时做样品空白溶液，经仪器分析后计算加标回收率及相对标准偏差（RSD，n=6）。结果如表2所示，3个抹茶样品的的加标回收率为102.3%~107.4%，RSD为1.7%~1.9%，满足含量测定要求。

2.6样品检测

依据1.3节样品前处理方法，对3批次抹茶样品进行前处理及检测。每批次样品平行制备两份，取两次的算术平均值为结果。按照标准要求，在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。经仪器分析获得茶氨酸浓度后，按1.5节公式计算茶氨酸含量。实验结果显示，3批次抹茶样品茶氨酸检测结果为15.33 g/kg、17.05 g/kg、15.12 g/kg。

3结论

针对抹茶基质严重干扰茶氨酸准确定量的问题，本研究在热水提取后增加了QuEChERS分散固相萃取净化步骤。实验表明，仅需一步净化即可有效去除色素、多酚等共提取物，净化后样品色谱图中干扰峰基本消失，峰纯度满足定性要求；加标回收率为102.3%~107.4%，RSD为1.7%~1.9%，准确度良好。本方法在不增加过多成本和时间的前提下，解决了标准方法在抹茶基质中适用性不足的痛点，具有较强的实用推广价值。

参考文献