2.2.2 色谱方法的建立
第一步,添加剂的选择在优化色谱条件时,首先考虑选择何种添加剂。由于化合物A呈弱碱性,而且我们采用正离子作为检测模式,所以为了保证化合物既在色谱柱上保留,又能够充分的进行离子化,选择0.1%的甲酸作为水相和有机相的添加剂。
第二步,色谱柱的选择在确定添加剂后,我们对色谱柱进行了考察。手头主要有两款,一是C18 (5μm, 2.1*150mm),另一款是Ultimate LP—C18 (5μm, 3.0*100mm)。在使用C18色谱柱时,流速为0.4mL/min、甲醇-水(0.1%甲酸)比例为70:30的条件下,系统压力大约在150bar左右。产生这么高的压力,可能原因有两个——一是柱子的内径为2.1um的;二是这款柱子相对于质谱常用柱而言,长度比较长,从而导致柱压较高。我们尝试了等度和梯度洗脱两种方式,但色谱峰的峰形均不理想。
色谱图如下:
后来我们看到月旭公司正在仪器信息网搞色谱柱免费申请试用活动,遂联系月旭公司相关负责人。他们根据我试验的具体情况,向我推荐了Ultimate LP—C18 (5μm, 3.0*100mm)这款色谱柱。接上色谱柱,按照说明书进行了柱子活化。
第三步,洗脱方式的选择然后考察了等度和梯度洗脱对色谱峰的影响。在等度洗脱条件下,甲醇-水在50:50时,化合物和内标在1min内出峰,这在进行生物样品分析时很难祛除内源性物质的干扰,也就无法避免基质效应对试验的影响。我们尝试增加水相的比例,但水相高的情况下化合物进入离子源后离子化效率降低,从而导致灵敏度降低。
等度洗脱色谱图
接下来我们考察了梯度洗脱,在初始流动相-水相为90%时,化合物A和内标B在6min左右出峰,总分析时长是10min。对于生物样品分析尤其是液质联用的高通量分析,分析时长太长。我们继续对这个洗脱条件进行优化,最后将A和B的出峰时间调节到5min左右。
梯度洗脱色谱图
色谱方法如下: