1.实验原理

多酚类化合物在碱性条件下，与Folin-Ciocalteu（磷钨酸－磷钼酸）试剂发生特异性反应形成蓝紫色物质，颜色深浅与多酚类化合物含量有关，反应产物对特定波长的有最大吸收，且吸光值与多酚的量在一定浓度范围内成线性关系。先以标准酚类物质建立标准曲线，再测定待测样品吸光值，可求出待测样品中多酚的含量，由此可对样品中多酚类化合物进行定量分析。

2.实验方法

酚类化合物是极好的氢或电子供体，由于形成的酚类游离基中间体的共振非定域作用和没有适合氧进攻的位置，比较稳定，不会引发新的游离基或者由于链反应而被迅速氧化，所以是很好的抗氧化剂。

具体实验方法是在96孔板中加入各样品，再加入FC试剂，混匀后加入碳酸钠溶液，摇匀后将孔板在37℃保温30分钟，于特定吸收波长下，迅速开始读数。抗氧化剂的TPC值是通过其吸收值与标准抗氧化物质没食子酸的吸收值相比得出的。TPC值以没食子酸当量mg Gallic acid equivalent/g (mg GA/g) 或者mg Gallic acid equivalent/L (mg GA/L)来表达。

3.波长扫描

以50、100 mg/L的没食子酸标准溶液，按照上述测定方法，在400nm-900nm间，以10nm为间隔扫描样品的吸收值，扫描图如图1：

图1 没食子酸标准溶液波长扫描图

从上图可以看出，样品在750nm处有最大的吸收值，因此选择750nm作为测定波长。

4.方法学的研究

4.1线性

标准曲线的绘制：精确称取0.2g没食子酸标准样品，蒸馏水溶解并定容至100mL，该标准液浓度为2000mg/L。准确量取上述标准液于10mL容量瓶中，依次稀释成400、200、100、50、25mg/L的标准溶液。分别取各标准溶液20μL，再加100μL FC试剂（稀释10倍），充分摇匀后，加入碳酸钠溶液80μL，在37℃保温30分钟，然后于750nm波长下测定吸收值，以没食子酸浓度为纵坐标(即最终稀释了10倍)，吸收值为横坐标，建立标准曲线（图2）。

图2 没食子酸标准曲线

结果表明，没食子酸在浓度为25～400mg/L内与其吸收值有良好的线性关系，在此范围内线性回归方程为Y=0.0043X-0.0214(R²=0.9996)。

4.2精密度

取1个酒稀释样品（1:4）按上述测定方法重复测定6次，结果如下表1：

表1 精密度实验

次数	1	2	3	4	5	6
吸收值	0.317	0.314	0.319	0.319	0.318	0.318
RSD%	0.59

6次测定的相对标准偏差是0.59%，说明总酚含量的测定方法精密度符合检测要求。

4.3重复性

分别取6个酒稀释样品（1:4），按上述测定方法测定其总酚含量，结果如下表2：

表2 重复性实验

批次	1	2	3	4	5	6
总酚含量（mg GA /L）	215.97	214.89	217.28	218.34	218.39	218.99
RSD%	0.73

6批样品测定总酚含量，平均值217.3mg GA/L，相对标准偏差是0.73%，说明总酚含量的测定方法重复性符合检测要求。

4.4稳定性

用某酒体样品（批号为2011031705，稀释1:4），按上述方法每30min测定1次，测定6次，结果如下表3：

表3 稳定性实验

时间/min	30	60	90	120	150	180
吸光值	0.229	0.228	0.229	0.229	0.227	0.225
RSD%	0.70

6次测定的相对标准偏差是0.70%，说明总酚含量的测定方法稳定性符合检测要求。

4.5回收率

选定1批酒体样品，准确测定其1:4稀释后的总酚含量为52.96mg GA /L，在10mL的容量瓶中分别加入200μL、250μL、300μL 2000mg/L的GA标准溶液，然后用稀释梯度样品定容至10mL（即相当于分别加入40、50、60mg/L的GA标准溶液），测定各自的结果，如下表4：

表4 回收率实验

测得值mg/L	实际值mg/L	回收率%
1	87.21	92.96	93.81
2	99.93	102.96	97.06
3	107.69	112.96	95.33

结果表明，三个回收率分别为93.81%、97.06%、95.33%，回收率符合检测要求，适用于酒体中的总酚含量的测定。

5.样品中总酚含量的测定

对三批酒体1、三批酒体2分别进行1:2、1:4、1:8、1:16、1:32五个梯度的稀释，依上述方法测定其总酚含量。

酒体2各稀释梯度浓度与其吸收值之间的线性关系（图3）：

图3 追风八珍酒各稀释梯度浓度与其吸收值之间的线性关系图

三批酒体2总酚含量的平均值是247.0 mg GA/L，相对标准偏差0.72%。（表5）

表5 追风八珍酒总酚含量

追风八珍酒	1	2	3	平均值	SD	RSD%
总酚含量	248.65733	245.12133	247.23533	247.00467	1.7792497	0.7203304

酒体1各稀释梯度浓度与其吸收值之间的线性关系（图4）：

图4 追风八珍酒各稀释梯度浓度与其吸收值之间的线性关系图

三批酒体1总酚含量的平均值是225.8 mg GA/L，相对标准偏差3.90%。（表6）

表6 中国劲酒总酚含量

中国劲酒	1	2	3	平均值	SD	RSD%
总酚含量	235.934	221.198	220.212	225.78133	8.8062778	3.9003569

6.小结与讨论

从以上各项数据表明，该检测方法具有良好的精密度、重复性与稳定性，回收率在93%—98%之间，因此该方法适合样品中总酚含量的检测。

①多酚类化合物与Folin-Ciocalteu（磷钨酸－磷钼酸）试剂发生特异性反应形成蓝紫色物质，一定要在碱性条件下进行，故试验选择Na₂CO₃作为显色用碱。此外，样品的稀释一定要用蒸馏水进行不能使用缓冲溶液，使用缓冲溶液会改变pH而生成白色絮状沉淀。

②酚类物质对自由基的清除能力归功于它结构上的酚羟基，它们具有供电子作用，通过提供活泼的氢捕捉活性氧等自由基，阻断了自由基对机体的损伤。另外，酚类物质也具有络合过渡金属离子能力、降低氧化酶活性的能力等。从机理上讲酚类物质抗氧化作用可归结两大方面，一是直接机理，清除自由基作用；二是间接机理，络合过渡金属离子作用。

③磷钼酸盐与磷钨酸盐具有氧化性，实验过程中要尽量排除样品中还原性物质（如柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸盐等）的干扰。

7.参考文献

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2. 于海龙，王栋中国现代实用医学杂志 2007年3月，第6卷，第3期

3. 徐辉艳，孙晓东，张佩君，李憬琦。濮智颖，李琼食品研究与开发 2009年3月，第30卷第3期

4. Singleton, V. L.，Orthofer, R.，Lamuela-Raventos，R. M. Methods Enzymol. 1999,299, 152-178.

5.Stevanato, R.; Fabris, S.; Momo, F. J. Agric.Food Chem. 2004, 52, 6287-6293.

6. LEE WAH KOH,LIN LING WONG,YING YAN LOO,STEFAN KASAPIS,AND DEJIAN HUANG J.Agric.Food Chem.,2010,58,148–154.

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