本实验所用伊文斯蓝等试剂系杭州纽蓝科技有限公司惠赠，在此谨表谢意。

1序言
在前文《利用有色溶液进行酶标仪期间核查的可行性分析》（http://bbs.instrument.com.cn/topic/6278521）结尾曾经提到，文中三种溶液的检测结果与标准曲线并未完全一致，A0、B3、C3并未在标准曲线中予以绘制。原因究竟是什么？且听我慢慢道来。
2研究的来由和目的
在进行有色溶液浓度与吸光度值线性关系研究时，首先将8个不同浓度与吸光度值进行线性关系研究，结果发现线性不佳，以检测630nm波长的伊文斯蓝溶液为例，如下图所示：

出现这个问题后，进行了原因分析：
1、排除试剂质量问题。所用的伊文斯蓝系sigma分装产品，有效期至2018年2月，出现质量问题的可能性不大；
2、排除移液器质量问题。所用移液器均经检定且在有效期内，近期还进行过期间核查，结果均为合格；
3、排除吸头质量问题。所用移液器吸头均为Thermo原装吸头，经硅烷化处理，溶液无粘壁现象，且移液器期间核查也使用该型号吸头，使用效果上佳。

最后，仔细分析上述曲线图，终于发现了一丝端倪，似乎低浓度时的线性还是不错的。于是将曲线图去除最高浓度点后重新绘制，结果如下：

一切真相大白！原来是酶标仪在高吸光度值时线性不佳，读数失真。为了探究该款酶标仪究竟在多少吸光度值时线性变差，进行了下列一系列实验。
3环境条件
温度25℃，湿度68%RH，无强光直射，无振动干扰，无噪声干扰，无磁场干扰，无电场干扰，无强气流影响，周围无易燃、易爆和腐蚀性气体，符合JJG861-2007要求。
4主要仪器设备及器材
4.1酶标仪：品牌略去；
4.2移液器：Thermo单道可调移液器，(100~1000)μL，分度值5μL；
4.3移液器：Thermo单道可调移液器，(20~200)μL，分度值1μL；
4.4酶标板：COSTAR9018，96孔U型。
5试剂
5.1伊文斯蓝：Sigma分装，含量>80%；
5.2纯水：自制；
5.3伊文斯蓝溶液：称取0.1g伊文斯蓝，溶于100 mL纯水中，摇匀，标记为C0（1000 ppm）。以C0为原液，用纯水作倍比稀释，分别得到500 ppm、250 ppm、125 ppm、62 ppm、31 ppm、16 ppm、8 ppm、4 ppm、2 ppm、1 ppm，标记为C1~C10。另取125ppm伊文斯蓝溶液，将其用纯水作适当稀释，配制成110 ppm、100 ppm、90 ppm、80 ppm、70 ppm溶液，标记为C3.1、C3.2、C3.3、C3.4、C3.5。
6测试及结果
按照下列顺序向酶标板各孔加入一定量的伊文斯蓝不同浓度溶液：

用酶标仪在630 nm进行测试，结果如下：

7分析
7.1溶液浓度1 ppm ~62 ppm

7.2溶液浓度1 ppm ~70 ppm

7.3溶液浓度1 ppm ~80 ppm

7.4溶液浓度1 ppm ~90 ppm

7.5溶液浓度1 ppm ~100 ppm

7.6溶液浓度1 ppm ~110 ppm

7.7溶液浓度1 ppm ~125 ppm

7.8不同浓度曲线回归方程及相关系数

8结论
结合不同浓度曲线及回归方程、相关系数，可以很明显看出，该酶标仪在吸光度值2.6以上时，线性明显变差，呈现“曲线降落”现象。
9讨论
9.1本次实验在1 ppm~62 ppm浓度区间得到的回归方程为y = 0.025537x + 0.0342，与前期实验得到的回归方程y = 0.025420x + 0.0243非常吻合，说明伊文斯蓝溶液用于酶标仪性能测试确实可行。

9.2按照本次实验在1 ppm~62 ppm浓度区间得到的回归方程y = 0.025537x + 0.0342，推算80ppm~125ppm的吸光度值并与实际测量值作比较，也可以发现在吸光度值2.6以上时呈现明显的曲线降落现象。

8.3本实验所用酶标仪说明书称线性范围为0-3.0OD，但通过实验证实其实际线性范围为0-2.6OD。提示我们在仪器使用过程中不应盲目信任说明书内容，而应通过恰当的手段予以证实，并将证实结果合理地应用于日常检测工作中。对于此台酶标仪来说，日常实验活动应将ELISA结果控制在吸光度值2.5以下，才能获得较理想的结果。

该帖子作者被版主 马踏飞燕加 20积分， 2经验，加分理由：原创加分