主题：【求助】液相方法验证

要确保每个浓度点都能制备出来就可以，内标和对照品100%浓度接近比较合适。如果是MS检测器，内标峰和样品峰是否重合无所谓

1、标准曲线一系列浓度点都是成比例增加或稀释的，但是总要从一个浓度开始操作吧，那怎么选这个对照品浓度去做标准曲线呢，每个文献都不一样，有什么依据吗？
答：标准曲线稀释，一般都会从高浓度母液稀释一个中间使用液体，然后从中间使用液种移取不同体积的标液至容器中，然后进行稀释获得曲线系列各个点的标液。这个没有规定的标准，基本上都是根据自己的经验来进行设置，移取体积不要太少，确保能准确移取。

2、是要随便进一个对照品浓度和进样量，然后去看信噪比>10找一个差不多的浓度把这个当做定量限，再选大于这浓度3-5倍的浓度当做标准曲线最低点吗？
答：对的，看信噪比时可以随便近一个浓度看一下峰面积和信噪比，然后折算一下当信噪比为10 时，这个标液的浓度大概为多少。本身信噪比这个选取就受人为干预，你选取的基线位置不同，其信噪比就不同，大概就行了。

3、那又怎么确保自己设置的标准曲线是可以把血浆样品待测物浓度范围包含住呢？我看有的论坛说是先估算自己样品浓度，但是这个不就是做实验要出来的结果吗，怎么自己提前预估呢？
答：是的，一般建议测试样品的浓度要落在线性范围内，这就要看你平常是否留意测试过的样品了，有经验的会知道自己测试的样品浓度大概再什么水平，如果不清楚的，随机挑选几个样品先测一下就知道了。

4、在方法学验证第一步专属性时，就要加入相对应的对照品和内标，那这时候怎么确定加入对照品个内标的量和浓度呢？有什么依据吗？是不是一开始就要定下来标准曲线浓度和内标浓度然后再做专属性？
答：做专属性不用考虑内标和曲线浓度，专属性是用来验证不同化合物之间是否会干扰，保留时间是否能完全分开，你只要确保所有用来做专属性的标样以及内标都能明显出峰和准确识别即可，一般建议进中间浓度标品。

5、我试着随便选浓度和剂量，进了一个只有对照品（1mg／ml）和内标（0.1mg/ml）的混合样品，但是都杂糅在一起了，而且血浆杂峰也是在前面几分钟出，这是不是意味着我的对照品和内标都不适合这个实验了？
答：对照品和内标要能完全分离，互不干扰，否则实验就没法做。出在一起可能是仪器条件没摸好，优化一下，当然也可以选择其它内标。

原文由 通标小菜鸟(v3141805) 发表:1、标准曲线一系列浓度点都是成比例增加或稀释的，但是总要从一个浓度开始操作吧，那怎么选这个对照品浓度去做标准曲线呢，每个文献都不一样，有什么依据吗？答：标准曲线稀释，一般都会从高浓度母液稀释一个中间使用液体，然后从中间使用液种移取不同体积的标液至容器中，然后进行稀释获得曲线系列各个点的标液。这个没有规定的标准，基本上都是根据自己的经验来进行设置，移取体积不要太少，确保能准确移取。2、是要随便进一个对照品浓度和进样量，然后去看信噪比>10找一个差不多的浓度把这个当做定量限，再选大于这浓度3-5倍的浓度当做标准曲线最低点吗？答：对的，看信噪比时可以随便近一个浓度看一下峰面积和信噪比，然后折算一下当信噪比为10 时，这个标液的浓度大概为多少。本身信噪比这个选取就受人为干预，你选取的基线位置不同，其信噪比就不同，大概就行了。3、那又怎么确保自己设置的标准曲线是可以把血浆样品待测物浓度范围包含住呢？我看有的论坛说是先估算自己样品浓度，但是这个不就是做实验要出来的结果吗，怎么自己提前预估呢？答：是的，一般建议测试样品的浓度要落在线性范围内，这就要看你平常是否留意测试过的样品了，有经验的会知道自己测试的样品浓度大概再什么水平，如果不清楚的，随机挑选几个样品先测一下就知道了。4、在方法学验证第一步专属性时，就要加入相对应的对照品和内标，那这时候怎么确定加入对照品个内标的量和浓度呢？有什么依据吗？是不是一开始就要定下来标准曲线浓度和内标浓度然后再做专属性？答：做专属性不用考虑内标和曲线浓度，专属性是用来验证不同化合物之间是否会干扰，保留时间是否能完全分开，你只要确保所有用来做专属性的标样以及内标都能明显出峰和准确识别即可，一般建议进中间浓度标品。5、我试着随便选浓度和剂量，进了一个只有对照品（1mg／ml）和内标（0.1mg/ml）的混合样品，但是都杂糅在一起了，而且血浆杂峰也是在前面几分钟出，这是不是意味着我的对照品和内标都不适合这个实验了？答：对照品和内标要能完全分离，互不干扰，否则实验就没法做。出在一起可能是仪器条件没摸好，优化一下，当然也可以选择其它内标。

很感谢老师的回复，因为是第一次周围也没有人做过相关实验，所以很多问题都不清楚也不知道咨询谁。老师您的回复已经解决我很多困惑了，我还有几个问题想请教一下
1、所以我现在还是先需要用标品和内标去摸条件达到二者能完全和杂峰分开，然后再去做后面的标曲，准确度精密度稳定性这些是吗？
2、您说的这个中间浓度，也是先用几个样本大概估算一下自己样品浓度范围，然后配置对应的中间浓度的标品去测试吗
3、血浆峰形完全分开也是需要保证分离度>1.5吗，
4、我试过甲醇：水，甲醇：0.1甲酸去分离，但是标品和文献里不一样，出峰时间很快在两三分钟，有什么方法能延长标品出峰时间和前面的血浆杂峰错开吗

原文由 液相色谱柱修复(Ins_9070be6a) 发表:要确保每个浓度点都能制备出来就可以，内标和对照品100%浓度接近比较合适。如果是MS检测器，内标峰和样品峰是否重合无所谓

谢谢老师，但是我做的是紫外线不是联合质谱，所以还是得让峰分开，请问老师您说的内标和对照品100%接近是什么意思，是内标浓度要选对照品最高点浓度吗？

原文由 Ins_6b875a98(Ins_6b875a98) 发表:谢谢老师，但是我做的是紫外线不是联合质谱，所以还是得让峰分开，请问老师您说的内标和对照品100%接近是什么意思，是内标浓度要选对照品最高点浓度吗？

意思是内标和对照品峰高和浓度尽量一致

原文由 通标小菜鸟(v3141805) 发表:意思是内标和对照品峰高和浓度尽量一致

好的谢谢老师，我今天又去试了一次，配的对照品和内标浓度都是一样的，请问这个图形的话可以用吗，看图时需要保证峰宽或者分离度的要求吗？这个图里内标在前，对照品在后，分的不是很开，而且对照品好像有点拖尾

原文由 Ins_6b875a98(Ins_6b875a98) 发表:好的谢谢老师，我今天又去试了一次，配的对照品和内标浓度都是一样的，请问这个图形的话可以用吗，看图时需要保证峰宽或者分离度的要求吗？这个图里内标在前，对照品在后，分的不是很开，而且对照品好像有点拖尾

同样条件下的空白血浆四分钟有个小峰，我的内标是4分钟，对照品是6分钟出峰

哈哈哈，我在DXY见过这个帖子好像