主题：【第六届原创】HPLC法测定果冻类样品中叶酸含量的方法学建立(局部)

1.前言与文献综述

1.1叶酸的理化性质，生物学功能

叶酸(folic acid)是一组含有碟酰谷氨酸结构的一类化合物统称。食物中的叶酸绝大多数是以喋酰多谷氨酸(或称多谷氨酸叶酸)的形式存在的。叶酸为淡黄色结晶粉末，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚及其它有机溶剂；叶酸的钠盐易溶于水，但在水溶液中易被光解破坏，分解成碟啶和氨基苯甲酰谷氨酸盐。在酸性溶液中对热不稳定，而在中性和碱性溶液中却十分稳定。食品中叶酸经受热易损失。

食物叶酸经小肠粘膜细胞内特异叶酰多谷氨酸水解酶的作用，水解为喋酰单谷氨酸(或称单谷氨酸叶酸，PteGlu)后吸收。吸收后的单谷氨酸叶酸一部分又转变为多谷氨酸叶酸，在肝脏、红细胞及其他组织细胞内贮存，其余部分则以单谷氨酸叶酸的形式分布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。肝脏的叶酸浓度是血浆的几百倍，但其单谷氨酸叶酸浓度与血浆相近。叶酸以8种辅酶形式存在于生物体内，为一碳单位的载体参与嘌呤、嘧啶等重要物质的合成。^[10] 因此叶酸在DNA、RNA、核酸和蛋白质的生物合成中起着重要作用，是细胞增殖和机体发育的物质基础。叶酸在体内的含量直接影响到多种物质如核苷酸的代谢，进而影响血细胞的形成。

1.2目前测定叶酸的一些主要方法以及对各个方法的评价

1.2.1微生物法

微生物法是检测生物体内叶酸的经典方法。它最根本的原理在于利用了微生物对于某些营养物质的特异性。大量的研究发现，某种微生物会对某种维生素具有极强的特异性，是其正常生长所必需的维生素，并且在一定条件下，其生长与繁殖速度与溶液中该维生素的含量成一定的对应关系，含量高则生长快，反之则慢，微生物法便利用了这种对应关系间接地测定出样品中该维生素的含量。通常所用的微生物有干酪样乳酸杆菌（L.casei）、粪链球菌和啤酒小球菌属。此3种微生物对不同形式叶酸的敏感度不同。粪链球菌只对非甲基化叶酸敏感，如PteGlu、二氢叶酸(DHF)和四氢叶酸(THF)。

微生物分析叶酸具有极高的灵敏度准确度高、先期投入少，见效快、测定结果反映了样品中具有生物活性的被测物含量等优点。许多国际标准方法机构仍旧将微生物法作为叶酸分析的标准方法或第一方法。

但是微生物法也有许多局限性，如整个实验周期长，批间检测结果重复性差，检测结果受样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响，只能反映维生素的总含量，不能测定维生素各种异构体的组成和含量等。

1.2.2同位素放射免疫法

同位素放射免疫法检测血清叶酸始于70年代初。该方法具有快速、简便的特点，同时由于叶酸放射免疫试剂盒的出现，很快得到普及，尤其广泛应用于临床实验室。

放射免疫法与微生物法检测叶酸，除原理不同外，检测结果的意义也有所不同。对大量标本总体而言，两种方法结果相关性较好，但对个体标本，两种方法结果的差异较大。微生物法对多谷氨酸叶酸响应值低，不能直接用于检测叶酸含量。但微生物法对所有单谷氨酸叶酸及其衍生物的反应灵敏度相同，故在用叶酸水解酶处理样品使所有叶酸形式转变为单谷氨酸叶酸后进行检测，可得到准确的叶酸值。同位素放射免疫法对多谷氨酸叶酸反应的相对灵敏度有较大的差别，随着叶酸浓度增加，反应的相对灵敏度增加，但多谷氨酸叶酸的反应曲线不可能与单谷氨酸叶酸的反应曲线重合；另一方面，多谷氨酸叶酸与结合蛋白的亲合性与单谷氨酸叶酸相比较高，不同的单谷氨酸叶酸衍生物反应灵敏度不同，放射免疫法也不适用于检测单谷氨酸叶酸衍生混合物。由于上述原因，尽管放射免疫法可用于检测和评价叶酸的营养状况，但从定量检测的角度来讲，难以得到准确的叶酸含量值。
    1.2.3离子捕获法

Wilson等提出离子 捕获法检测叶酸，该技术可谓叶酸检测技术中的最新方法，即在实验中，样品加入变性剂后叶酸与内源性结合蛋白分离，释放后的叶酸再与带有大量阴离子的亲合试剂结合，合成产物经过离子捕获池而与阳离子纤维结合，最后通过碱性磷酸酶与喋酸(叶酸的类似物)结合物对叶酸结合蛋白上游离结合位点的探查，定量分析样品的叶酸含量。该研究证实，离子捕获法测定血清或红细胞叶酸，其结果与同位素放射免疫法的结果具有良好的相关性，相关系数分别为0.96 和0.93。

1.3色谱法和HPLC法在测定食品中叶酸含量的现状

色谱法也称层析法，是一种分配平衡为基础的分离分析技术。色谱分离体系包含两相：固定相和流动相。由流动相带领的物质分子在固定相间分配达到“平衡”的过程。通过不同物质分配平衡性质的差异达到彼此分离。

20世纪70年代初发展起来的高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC）吸收了普通液相层析和气相色谱的优点，经过适当改进发展起来的。它既有普通液相层析的功能（可在常温下分离制备水溶性物质），又有气相色谱诸多优点（高速、高分辨率和高灵敏度）。适用于很多不易挥发、受热易分解的物质定性定量分析。^[9]





运用高效液相色谱（HPLC）方法来定量食品中叶酸含量在近年来得到了普及。借助于色谱柱的高分离效果和灵敏的检测器，有能力来分离检测不同形式叶酸。中国药典方法使用高效液相色谱－紫外检测器检测叶酸。由于有些叶酸具有荧光特性，D.M P.Johan等^[2]使用高效液相色谱－荧光－紫外检测器的串连（HPLC-FD-UV）分析面包酵母中叶酸含量。R.Stefania^[4]等同样使用HPLC-FD-UV分析意大利食品中叶酸含量。由于食品中的干扰物质多，且叶酸含量较少，E.J.M.Konings^[5] 使用固相萃取法（SPE）对样品进行纯化和富集，然后使用HPLC-FD-UV检测牛奶，肝脏，蔬菜，面粉中的叶酸。L.H Douglas^[7] 等用HPLC-柱前衍生和HPLC-电化学检测器分别检测牛奶和其它食品中叶酸含量。随着技术的进步，高效液相色谱和质谱联用（HPLC-MS）提供了专一性好，灵敏的方法。A.Freisleben^[8]使用LC-FD-MS联用检测食品中叶酸含量。

表一：几种液相色谱联用的检测器方法的比较：

Table 1. Comparison of some detectors of HPLC

检测器	原理	灵敏度	专一性	检测限①	评注
紫外 (UV)	物质在紫外光谱有吸收	较高	稍强	2μg/100mL	受到食品中其它物质干扰较大。
荧光 (FD)	共轭结构在激发光下电子激发到高能态，退激回基态时能量以荧光形式释放，根据荧光强度得待测物浓度。	高	强	不能检测	能检测四氢叶酸和5－甲基四氢叶酸。而叶酸（Pt-Glu）②无荧光性质。
电化学(ECD)	外加电压使特征物质失去电子，根据失去电子形成电流大小得出待测物质的浓度。	高	强	0.32pmol	灵敏度高，专一性强。但是装备复杂。
质谱 (MS)	特征碎片离子检测	较高	强	0.1μg/100mL	不普及，价格高。但是发展方向。

①检测限是以叶酸（Pt-Glu）来计算。

②Pt-Glu 是Pteroylglutamic Acid

1.4方法学建立的目的和意义以及技术路线、

1.4.1方法学建立的目的和意义

由于人体内的叶酸几乎完全依赖于食物的摄入，因此当摄入量不足或利用率低时，体内便会出现叶酸缺乏的状况。近年来的研究表明，叶酸缺乏会导致贫血、慢性下痢、食欲不振、发育迟缓等疾病，孕妇补充叶酸可防止因神经系统发育不全而形成的畸胎，儿童服用叶酸可提高智商，促进智力发展。所以，叶酸强化食品的摄取对人类健康具有重要意义。而叶酸强化食品的含量的科学性显得十分重要。

确实食品添加剂的质和量决定着加工类食品的营养和安全性。国外对于食品营养和安全十分关注，通过在加工食品的包装上注明的添加成分、营养物质的含量、适宜人群在产品包装，以利于不同需求的消费者选择。随着国内外交流的加强和HACCP认证的推进以及质量意识的增强，食品安全，食品营养受到了消费者和食品生产企业的关注。随着分析测试仪器的先进化和自动化给食品中各个成分的测定提供了强有力的“武器”，尤其是高效液相色谱的普及，它的高效性、准确性、方便、微量等优点是食品分析的一场“革命”。国内外HPLC法测定食品营养成份和食品添加剂方法发展得很快，相关报道较多。但是由于叶酸在食品中添加量甚微，食品中干扰物质较多，所以相应的文章报道相对较少。基于以上考虑设立本项目，具体目的有以下四点：

1、建立高效液相色谱方法分离分析果冻类样品中叶酸含量的方法学；

2、通过色谱条件的摸索和优化，获得叶酸分离的最佳条件；

3、对样品前处理条件的摸索和调整，得到简便、快速、有效的样品前处理方法；

4、通过对本套方法学的验证包括线性、精密度、回收率、稳定性等实验，建立可靠、完善、准确的测定果冻类样品中叶酸含量的方法学。

本方法的建立，可为检测果冻类样品中叶酸含量提供可靠和准确的手段，也为检测其他食品中叶酸含量提供参考资料，所以本研究具有社会效益和经济价值。

1.4.2技术路线

色谱条件的建立（流动相配比、色谱柱选取、检测波长、流速、柱温）  →  积分条件的建立 →    确立标准品、样品配制方法→ 方法学验证（线性回归、精密度、回收率、稳定性、样品含量测定）→方法学的改进

2.实验部分

2.1实验样品的描述

2.1.1样品性质

无色或淡黄色果胶类样品。常温下为胶态和液态混合物。样品名称（Amino **；Amino ***ア；Amino ***ズ）。

2.1.2样品中添加的主要物质

添加氨基酸，维生素类，甜味剂，食用香精，食用色素，有机酸。

2.1.3可能的干扰因素

根据配料表信息，氨基酸、甜味剂、色素等物质在样品中较维生素几十倍量添加，而维生素中又以维生素C添加量最大，叶酸添加量相当少。所以上述物质对叶酸分析造成较大的干扰。

2.1.4标准品和样品保存条件

标准品避光保存于冰箱冷冻柜中。样品置于-18℃冷藏库中保存。



2.2实验条件

2.2.1仪器和试剂及标准品

仪器配置：岛津LC-10A系列

              泵：LC-10ADVP

真空脱气机：DGU-12A

控制器：SCL-10AVP

紫外检测器：SPD-10AVP

自动进样器：SIL-10ADVP

柱温箱：CTO-10ASVP

积分仪：CR-8A和LC-Solution积分工作站

试剂：磷酸二氢钾（GR），氢氧化钾（GR），甲醇（HPLC），氨水（GR），纯水（HPLC）

标准品：叶酸标准品（Pteroylglutamic Acid），纯度：98.0～102.0％ 特级

2.2.2 HPLC方法条件建立

以下略去n个字

6.参考文献
[1]    中国药典编委会．中国药典（2000）二部，北京：化学工业出版社，2000
[2]    Johan D.M. P.; Jelena A. J.; Sofia B.H., Development of a Simplified Method for the Determination of Folates in Baker’s Yeast by HP$$lc with Ultraviolet and Fluorescence Detection. J.Agric. Food Chem. 2005,53: 2406-2411
[3]    Douglas L.H.; Randy L.W.;Michael G.Z., Determination of native folates in milk and other dairy products by high-performance liquid chromatography. J.Chrom. 1988, 449 : 271-279
[4]    Stefania R.;Liisa T.V.; Altero A., Determination of folate vitamers in food and in Italian reference diet by high-performance liquid chromatography.J.Chrom A . 1999, 855: 237-245
[5]    Konings EJM，A validated $$lc method for the determination of folates in vegetables, milk powder, liver and flour. J AOAC Int.  1999, 82: 119-127
[6]    Eduward Chu. ; James C.Drake. ; Donna Boarman, Mechanism of Thymidylate Synthase Inhibition by Methotrexate in Human Neoplastic Cell Lines and Normal Human Myeloid Progenitor, J. Biochem. 1990,265: 8470-8473
[7]    Pamela J.Bagley; Jacob selhub, Analysis of Folate Form Distribution by Affinity Followed by Reversed-Phase Chromatography with Electrochemical Detection, Clin. Chem. 2000, 46: 404
[8]    Freisleben A.; Schieberle P.; Rychlik M., Comparison of folate quantification in foods by hight-performance liquid chromatography-fluorescence detection to that by stable isotope dilution assays using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 2003, 315: 247-255
[9]     赵永芳.生物化学技术原理及应用(第三版)．北京：科学出版社，2003
[10] 吴坤等.营养与食品卫生学（第五版）．北京：人民卫生出版社，2005

本人的毕业论文啊。。。。

拿出来晒晒。想起当时做HPLC 的点滴。。。  想想现在又开始 做简单的化验，

郁闷之心油然而生。

想当年，意气风发，挥斥方筹。叹如今，日薄西山，望洋心叹。

注意，引用我的文章和段落，请注明，这些都是本人 一个个字推敲过的。本文没有

发表过。引用我文章段落的朋友，注明出处。

致谢：
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感谢远在荷兰的Konings教授，德国的Freisleben教授。我在网上查阅到他们曾经发表过叶酸分析的论文，但是上海图书馆没有这几篇文献。我抱着尝试的心态给他们写信，希望能寄给我他们的文章。十分幸运，两位学者不仅提供了他们对于研究食品中叶酸的高效液相分析的论文，而且Konings教授多次写信给我，给我提出许多很好的建议以及他的经验。两位欧洲的教授与我素不相识，但是他们这么热情地帮助，使我感动。

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当时虽然工作较辛苦,但是这就是青春的经历。四年前的经历让我在工作中终身受益。

感谢这十八年来帮助过我所有的老师，同学，朋友，亲人和不认识的朋友们。感恩是美好的回报！

感谢这生气勃勃时代也感谢这美好的青春年华！

    笔者：

二〇〇六年十一月于上海

楼主，你那张样品图，不行吧，分离度太差了，明显是两个峰。从质量分析的角度来说，你的系统是不成功的。没有人对此提出过意见？

而且样品主峰的保留时间与标准品不一致，按照欧盟的规定保留时间如果相差2.5%，就怀疑不是一个物质，所以你的回收率数据，我表示怀疑。没有恶意，

呵呵。放上的那张图是 没有提纯的。样品后来用 固相萃取方法提纯过的。  感谢楼上朋友的建议，谢谢。不过，现在我都不做HPLC了。