主题：【资料】多维色谱技术(45讲 待续)

多维色谱技术（32）
                第3章  多维高分辨气相色谱

3.2 实际中应用的二维气相色谱

3.2.3 Deans切换（2）

（参考前一讲） 
             
(b) 样品转移的第二个压力配置使两支色谱柱以串联凡是连接起来，在交汇点A处分流，让一小部分气流进入检测器 1，大部分气流进入第二支色谱柱。


(c) 分离出来馏分的分析——一旦样品转移完成，就采用第三个压力配置，通过调节B来的气体让交汇点A有剩余的压力，保持载气通过第二支色谱柱，同时第一支色谱柱也利用从B出来的气体进行反吹。
    在第一支色谱柱反吹以后，在第二支色谱柱上进行被测物的分离，然后系统恢复到原来的预分离位置，准备第二次进样。
      这一系统可以增加一支石英毛细管限流器使其更为灵活，限流器用做溢流，通过电磁阀避免被分析物的反向扩散，在第一支和第二支柱之间增加预浓缩阶段可以避免在第二支柱上出现的色谱峰的加宽。


文献来源：L.MONDELLO, A.C. LEWIS, K. D. BARTLE,” Multidimensional
Chromatography”, John Wiley & Sons Ltd, 2002

多维色谱技术（33）

                第三章  多维高分辨气相色谱

3.2 实际中应用的二维气相色谱

3.2.4  柱间调制捕集

      两支色谱柱最简单的结合是在一个柱箱内两柱中间进行切换，这种方式可以适应许多复杂混合物的分析，也许在被分析物进入第二支色谱柱之前，对设备有很大的改进余地，但是由于在第一支色谱柱带来的谱带变宽，限制了第二支色谱柱分离能力，所以改进主要集中在减少峰的扩散效应，让被分析物得到重新聚焦。有许多方法可以实现重新聚焦，包括用冷阱进行热聚焦，冷却通常使用CO2或液氮，保持色谱柱的热调制，或者在第二支  色谱柱程序升温之前进行柱头浓缩，W. Bertsch 强调了重新聚焦有许多优点：
  (i)可以准确地知道第二支色谱柱的起始时间，
  (ii) 在进样之前可组合几个中心切割为一体，
  (iii)可以把高流速的填充柱和低流速的毛细管柱连接起来，(iv) 多重富集提高灵敏度，(v) 减小谱带变宽，(vi)可增加附加的进样口，以便加入标准样，以及(vii) 分析柱可以用不同的载气进入第一支色谱柱来运行。
    虽然这些潜在的优点也许在实际中难以实现，但是他们强调在两柱中间能够重新聚焦。
      自然，二维色谱的第二支色谱柱上这种谱带的压缩是十分重要的，在全二维气相色谱中应用了这一技术。
      实际使用中的冷冻捕集有很大的差别，在毛细管气相色谱系统中使用完全自动化的冷冻捕集，在GC-GC的联结中完全可以接受这种自动化的装置，这一装置原来是为了顶空分析而设计的，最为简单的重聚焦装置是把一段段毛细管放在装液氮的杜瓦瓶中即可。毛细管的热质量很小冷冻液可以很快地使被分析物降温，这样一来使进入第二支色谱柱的进样峰很窄，但是要十分小心，保证被分析物在中间转移中完全被保留，同时在这一过程中要使用薄的液膜。浸入液氮的毛细管中涂渍聚硅氧烷是特别合适的，因为聚硅氧烷在低温下仍然呈液态，而其它常用的固定相如聚乙二醇就不合适了，因为它在低温下成为固态物了。
另外一种热调制是使用一段长的厚液膜毛细管柱，用以在常温下保留半挥发性被分析物，一旦把它加热时被分析物释放出来进入第二支色谱柱。这种中间捕集中的快速的循环用于全二维气相色谱。


文献来源：L.MONDELLO, A.C. LEWIS, K. D. BARTLE,” Multidimensional
Chromatography”, John Wiley & Sons Ltd, 2002

            多维色谱技术（34）

第3章  多维高分辨气相色谱

3.2 实际中应用的二维气相色谱

3.2.5 多柱箱
      Fenimore 等在1973首次报道了两支色谱柱在不同的柱温箱中运行的系统[1]，见图34-1和图34-2。在这一特殊的应用中需要使用两个柱箱系统，以包持检测器的稳定，需要对第二支色谱柱的温度进行精确控制，开始使用这样的系统时两个柱温箱的温度必须进行独立地精确控制，以保证分离的快速和高分离度。要通过柱头冷却到第二支色谱柱上来达到重新聚焦，在进行程序升温实现二维色谱，要使用多柱箱保持不同的温度，这就要大大增加设备的投资，但是它比单一柱箱有以下的优点：

(a) 可以把高温固定相的色谱柱和热稳定性较差的色谱柱一起使用，相当于把高稳定性的交联甲基聚硅氧烷柱和高极性（但是热稳定性较差）的聚乙二醇柱或多孔层开管柱(PLOT)结合在一起使用;

(b)  保持两个独立的柱箱温度可以让保留指数的精确度提高;

(c)  能调节两个相连接色谱柱温度以便优化固定相的选择性;

(d)  从第一支色谱柱流出的被分析物重新聚焦并转移到第二支色谱柱上。



图 34-2 Fenimore双柱箱系统中八通阀的切换示意图


[1]. D. C. Fenimore, R. R. Freeman and P. R. Loy, ‘Determination of Δ9-tetrahydrocannabinol in blood by electron capture gas chromatography’, Anal. Chem. 1973，45: 2331–2335


文献来源：L.MONDELLO, A.C. LEWIS, K. D. BARTLE,
”Multidimensional Chromatography”, John Wiley & Sons Ltd, 2002

多维色谱技术（35）
                第3章  多维高分辨气相色谱

3.2 实际中应用的二维气相色谱

3.3 二维气相色谱的应用实例

    接触一些实际应用的例子有助于理解GC-GC分离的原理，在过去30多年里主要有三个领域应用二维气相色谱：

1．  石油、燃料、工业原料、和燃烧分析。
2．  香料、调料、和食品。
3．  环境污染物。

      多维色谱在所有这些领域中得到充分的应用，二维气相色谱只是这些联用方法中的一个方法。这些联用技术的应用将在第10、13、14章阐述，本章只做些简要的介绍证明它在实际当中的特殊应用。从发表的文章数可以看到二维气相色谱的发展情况，上世纪90年带每年大约有1000篇单柱GC的文章，约有750篇为GC-MS的联用技术，每年只有50篇二维气相色谱的文章，当然这并不说明全部二维气相色谱被使用的情况，但是也说明二维气相色谱远不如GC-MS被重视的情况。
    在单柱GC和GC-MS有明显缺点的应用领域里，二维气相色谱会发挥其特殊的优点，大量用于燃料和环境分析领域的样品多涉及脂肪族和芳香族化合物的分析，这类样品常常很难用质谱进行分析，而对异够体的分离常常是需要利用色谱来解决。与此类似情况，有机卤代物和香料/调料的分析常常需要对手性异构体进行定量分析，这些化合物和脂肪族异构体一样，产生高度近似的质谱图，在这种情况下只能使用高分离度的色谱解决问题。

3.3.1 石油、燃料、工业原料、和燃烧分析的方法

      正如在本章开始就说明的，原油的族分离是多维色谱应用的活跃领域，精确定量分析这种混合物的组成不仅在工业上十分重要，在诊断环境因果关系和影响也极为重要。作为混合物燃料类型的样品很明显也是利用多维色谱进行分析的对象，因为这种样品含有大量的脂肪族烃类化合物，这种样品的复杂性和异构体的数量极为惊人，例如在柴油的C10～C25部分里有多达4×107个异构体[1]。

[1]  H. J. Neumann, B. Paczynska-Lahme and D. Severin, Geology of Petroleum, Vol. 5,Composition and Properties of Petroleum, Ferdinand Enke, Stuttgart Germany (1981)

文献来源：L.MONDELLO, A.C. LEWIS, K. D. BARTLE,” Multidimensional Chromatography”, John Wiley & Sons Ltd, 2002

  多维色谱技术（36）

第3章  多维高分辨气相色谱

3.2 实际中应用的二维气相色谱（2）

    在所有燃料和工业原料的分析中，单支色谱柱的柱容量远远不能满足所有组分的分离，以及PIONA（paraffins[脂肪烃]、isoparaffins[异构脂肪烃]、olefins[烯烃]、Naphthenes [环烷烃]、aromatics [芳烃]）组分的分析，对这些组分的分析具有很大的挑战性。
    1971年二维GC首先用于PIONA的工业分析，这一方法后来得到普遍接受，ASTM的标准PIONA分析方法很复杂`，多次进样，使用2支到5支平行的第二支GC色谱柱，用阀进行转换，色谱柱进行单独地控制。即使这样也不能把也不能把所有混合物达到全部的基线分离，但是却可以对关键性目标化合物进行分析。一般上这一类型的GC–GC分析对凝聚相物质相对于挥发相物质要进行最优化处理，挥发性更强的混合物如排除物或炼场气，也是很复杂的混合物，在单一色谱柱上难以得到完全的分离。在这种情况下要把气相组分和难挥发组分实现进行分离，以免污染检测器和色谱柱。早期的GC-GC应用使用填充柱和液膜毛细管柱的二维色谱柱，现在使用反吹的液膜预柱和PLOT柱相结合。在这样一来的设置中，使用高保留的PLOT柱要把不挥发性物质完全排除，否则就会产生不可逆吸附。
    石油化工的工业原料也是广泛应用二维GC的另外一个领域，了解制造过程中原料和中间体的组成的详细情况是获得产品正确成分的重要途径。在石油化工分析中应用气相色谱有典型的例子，Journal of High Resolution Chromatography 中有更多的事例。在许多应用二维GC分析烃类及其相关分析中，其定量分析的结果要优于GC-MS的方法。由于利用色谱可以达到要求的分离度，就可以利用性能优良的检测器如火焰离子化检测器（FID）来代替不易于定量的MS检测。分离出各种多环芳烃烷基取代物具有巨大商业价值，这种化合物可以作为水成岩地质历史的标记物，对探测油储量具有重要的作用。但是要分离出芳香族化合物的烷基取代物是多维GC的典型方法。芳香族烷基取代物的有很多很多，单独使用MS的去卷积问题还不清楚，所以直接单独测定这些异构体的准确方法要使用色谱技术。在1992年Schäfer 和 Höltkemeir 。使用二维GC以令人满意的选择性和分离度从2,3-二甲基萘中分离出1,4-二甲基萘，而不需要使用MS方法，在这一方法中有效地使用了Deans切换技术，把原油中的一些组分从第一支低极性柱转移到第二支极性柱（50 %苯基/25%氰丙基聚硅氧烷）中进行分离。图3-4就是中心切割分离的色谱图。


图 3-4 从原油中分离二甲基萘的二维GC色谱图，使用50 m甲基（(95%)/苯基（5%）做一维色谱柱，50m 甲基（(50%)/苯基（25%）/氰丙基（25%）作二维色谱柱，上面是一维柱的色谱。下面的图是二维色谱柱分离中心切割柱的色谱图。

文献来源：L.MONDELLO, A.C. LEWIS, K. D. BARTLE,” Multidimensional
Chromatography”, John Wiley & Sons Ltd, 2002

多维色谱技术（37）
          第3章  多维高分辨气相色

3.2 实际中应用的二维气相色谱（3）
      ——香烟凝缩油的二维气相色谱

      燃烧产物的分析也类似于燃很难分析的对象，常常存在没有燃烧完全的烃类基体，其中有很重要被人们关注的组分，例如浓度很低的致癌物质或诱导有机体突变的物质。典型应用是用多维GC色谱进行香烟凝缩油的分析，Gordon 等人报道[23]色谱分析图谱见图3-5,从图中看出即使是从一维色谱柱中心切割的很小的一部分也非常复杂。也有用Deans 的切换技术处理这种样品的，从一维色谱柱切割的每一部分只含有少量的组分，而在第二支色谱柱（使用极性分离而不是按沸点进行分离）分离时又分离出许多成分来，二维色谱图的复杂性，就必须要用程序升温，所以要用两个独立的色谱柱箱。在分离香烟凝缩物时即使在第二支色谱柱上使用程序升温也有困难，虽然分离系统有足够的容量，也需要有更多维的色谱柱对这一样品进行充分的表征。在这个例子里，按族对这一混合物进行分类以获得更多的化学信息是有意义的，另外还要使用质谱提供一个特殊的分析信息。


图 3-5 使用非极性柱和极性柱分析香烟凝缩油的二维气相色谱图
 
    上面的色谱图是用一维色谱柱分离香烟凝缩油的色谱，下面的四个色谱图是从一维柱中心切割转移到第二维色谱柱上（1-2min）的色谱图。（B.M. Gordon  et al. J. Chromatogr. Sci. 1988, 26：174）

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Chromatography”, John Wiley & Sons Ltd, 2002

          多维色谱技术（38）

      第3章  多维高分辨气相色谱

3.2 实际中应用的二维气相色谱（4）——二维气相色谱在环境分析中的应用

      二维色谱在环境中的一些应用，像燃烧排放物影响环境的研究，成为导向性的研究结果，在空气中芳香族化合物的分析，尽管样品预浓缩很重要，但是和石油化工分析相类似，致癌物多环芳烃，特别是含氮和含氧多环芳烃在流行病学方面很重要。分析大气中这些物质和燃料分析类似，有同样的困难，其中高浓度的脂肪族化合物常常掩蔽目标化合物，使用多维色谱GC-GC和LC-GC常常会得到很好的分离，使用FID定量时简单易行，在本书的第十三章有一些这样的例子。从技术角度这一应用值得提倡，使用二维色谱的恒温条件下的分析可以缩短分析时间。特别是分析空气中的异戊二烯和二甲基硫的分析，它使用了阀转移系统，并且使用非极性的PLOT柱进行压力程序分析[1]。虽然在环境中的应用不是太多，可是GC-GC提供了一种针对复杂混合物极有潜力去卷积的方法，同时可以使用很简单的分析系统得到重复性的结果。A. C. Lewis 等[1]开发了分析空气中异戊二烯和二甲基硫的二维气相色谱方法，分析设备如图38所示。



图 38 二维气相色谱方法分析空气中异戊二烯和二甲基硫的设备

      在这一二维气相色谱系统里使用程序升温进样系统(PTV)，同时分析异戊二烯和二甲基硫，一维色谱柱使用非极性柱（16m ×0.32mmi.d.厚液膜聚二甲基硅氧烷柱），柱温55℃，载气流速为17 mL/min，在中心切割向第二维色谱柱转移时流速为 14 mL/min。一维色谱柱进行反吹时的载气流速为24 mL/min。第二支色谱柱是选择性强的色谱柱，分析周期为12 min。


[1]  A. C. Lewis et al., Environ. Sci. Technol. 1997, 31:3209-3217
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Chromatography”, John Wiley & Sons Ltd, 2002

多维色谱技术（39）

第3章  多维高分辨气相色谱

3.2 实际中应用的二维气相色谱（5）——香料、调料和食品

3.3.2香料、调料和食品分析的方法

      这一类样品的分析极有实用价值，香料、调料是极为复杂的样品，同时其中的一些成分含量很低，对这一领域样品的分析，需要知道它们的结构或功能团，还要使用质谱或通过人类感官的判断进行评估，使用人类的感官的判断方法（如使用人的鼻子来‘检测’混合物的组成），这常常是解决用gc分离复杂混合物的重要补充。理想的情况下检测色谱图上的每一个峰对应检测器上的一个组分，这种情况不多，常常是一个保留时间仅仅是缩小感官评估的一组化合物，而常常会有这样的情况，用鼻子检测出来的化合物，不一定用检测器上显示出来，为了要克服这一困难，那就要把样品进行预浓缩，以提高基体的浓度、增加色谱系统的峰容量。在这样的分析中把二维气相色谱和多种样品处理结合起来，会起很重要的作用，并在进样系统中进行浓缩[1-3]。在进入第一支色谱柱分离之前把样品进行浓缩，这是有效地获得目标化合物的第一步，之后在两个柱子之间再进行“柱上”聚焦，这一工作可以通过同一色谱柱保留时间的多次中心切割，或者通过色谱谱带压缩，使第二支色谱柱进入检测器的谱带变窄（因而增加单位时间流出质量）。自然样品浓缩得到富集是这一领域分析的关键所在，因为需要从NMR 或 IR得到补充的信息，也需要和MS直接联机进行检测，可是NMR 或 IR需要比MS高得多的浓度才行，所以要得到更多的样品量是一个具有很大挑战性的问题。
  许多利用二维gc分析香料和调料的工作集中在检测产品的好坏，而不是鉴定其活性的香味成分[4]，而Nitz等人的工作是证明使用多维色谱分离结合人的嗅觉进行评估[5]。
      此后的研究是使用二维gc检测麦粒，先进行预分离，随之进行分离，感官检查，最后分离开的组分进行进一步的分析，最后阶段的工作是进行微量制备获得足够量的样品进行谱学鉴定。鉴定出一种含量很低的没有嗅到的物质2-甲基异冰片，它与高浓度的组分一起流出来，用简单的一维gc-MS和感官检测不出来。

文献
[1]. S. Blomberg and J. Roeraade, ‘Preparative capillary gas chromatography. II. Fraction collection on traps coated with a very thick-film of immobilized stationary phase’,J. Chromatogr.， 1987394:443–453

[2]. J. P. E. M. Rijks and J. A. Rijks, ‘Programmed cold sample introduction and multidimensional preparative capillary gas chromatography. Part I: introduction, design and operation of a new mass  flow controlled multidimensional gc system’,
J. High Resolut. Chromatogr.， 1990， 13:261–266

[3]. O. Nishimura, ‘Application of a thermal desorption cold trap injector to multidimensional gc and gc–MS’, J. High Resolut. Chromatogr.，1995， 18:699–704

[4]. R. H. M. van Ingen and L. M. Nijssen, ‘Determination of diethylene glycol monoethyl ether in flavors by two-dimensional capillary gas chromatography’, J. High Resolut.Chromatogr.， 1989，12:484–485

[5]. S. Nitz, F. Drawert, M. Albrecht and U. Gellert, ‘Micropreparative system for enrichment of capillary gc effluents’, J. High Resolut. Chromtogr.，1988，11:322–327

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多维色谱技术（40）

              第3章  多维高分辨气相色谱

3.2 实际中应用的二维气相色谱（6）——橙油萃取物的色谱

    分析令人愉快气味的样品如水果和萃取出来的香精油也是利用二维gc的领域，利用二维gc分析水果萃取物和产品开始于上世纪80年代中期，以后就有不少研究工作发表[1，2]，图3.6是用二维gc分析橙油萃取物[32]的色谱图，一维色谱柱是非极性的，二维色谱柱是Carbowax 20M柱，二维gc结合感官检测能够鉴别出低浓度（但是有气味特征）化合物，β-香叶烯，在单柱分析时会和主要成分一起流出，使用非极性柱和PEG柱的二维gc，用Deans 无阀切换做接口，使用很短时间的中心切割，可以不需要中间的捕集阱，使用两个独立的柱箱，第二个柱箱在恒温下操作[3]。


图 3.6 二维gc分离橙油萃取物的色谱，在这一色谱中在区域A中是2s 的中心切割部分，在这一时段β-香叶烯从第一支非极性色谱柱流出。在第二支Carbowax 20M极性色谱柱流出的两个化合物（不知到成分，是用感官鉴别的）（P. A.Rodriguez and C. L. Eddy, J. Chromatogr Sci. 1986, 24：18

文献
[1]. D. W. Wright, K. O. Mahler and L. B. Ballard, ‘The application of an expanded multidimensional gc system to complex fragrance evaluations’, J. Chromatogr. Sci.  24:60–65 (1986).
[2]. M. Herraiz, G. Reglero, T. Herraiz and E. Loyola, ‘Analysis of wine distillates made from muscat grapes (Pisco) by multidimensional gas chromatography and mass spectrometry’, J. Agric. Food Chem. 38: 1540–1543 (1990).
[3]. P. A. Rodriguez and C. L. Eddy, ‘Use of a two-dimensional gas chromatograph in the organoleptic evaluation of an orange extract’, J. Chromatogr. Sci. 24:18 – 21 (1986).

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多维色谱技术（41）

                第3章  多维高分辨气相色谱

3.2 实际中应用的二维气相色谱（7）—— 对映体的分离

      天然产物中有有机挥发性物质的测定需要有手性分离的技术，最常见的分离对象是在精油中的萜烯和倍半萜烯类化合物，这些化合物是生物因素的指示剂，如生长季节、地理位置、气候等，这些化合物也被许多植物和树木直接释放到大气中，也对全球生物化学循环作出重要贡献。
      对映体的分离可以使用GC–GC，把非极性柱作为第一支色谱柱进行初步分离，把手性柱作为第二支柱进行手性化合物的分离。手性GC色谱柱在上世纪70年代末出现,带手性色谱柱的二维GC是在1983出现，使用Deans无阀切换技术分离氨基酸。近年使用GC-GC的工作用于香料工业，包括Mondello等人和Mosandl 等人的工作。近来Mondello 使用现代化的阀件，不用中间预浓缩器的快速转移技术方法，不会使峰的谱带加宽。

      往天然产物中假如合成化合物叫做“掺假货”，这在食品工业中常常出现，但是加入的化合物常常是手性化合物，例如往橙汁中加入萜烯类化合物，往天然化合物中加入的合成萜烯有多少，可以用测定手性化合物的量来判断，因为合成的萜烯类化合物是消旋的，长时间以来GC-GC是解决这一问题的重要手段[38]。
图3.7 是早期这类分析的例子，说明用GC测定果汁中内酯的立体异构体的色谱（a）(其中比例数是对映体的比例)，（b）是酸乳酪，没有对映体的比例，说明没有掺假。

      不管任何形式的分析，确定分析系统的完整性是很重要的，要确定在分析过程中没有引入人工合成品。这一点在做手性分析时尤其重要，例如内酯的降解和在传输管中有furanon化合物。色谱仪中的接头、进样器、分流器都是最有可能引起化合物降解的部位，要尽量减少它们带来的问题。但是有些化合物像甲基丁烯醇可能会在自然中产生，它会在色谱柱中脱氢后生成异戊二烯。



图 3.7 (a) (i)果汁饮料用二氯甲烷萃取物在第一支非极性色谱柱上进行中心切割后的色谱 (ii) 癸烷基（C10），十一烷基（C11）和十二 烷基（C12）内酯外消旋混合物，在进行中心切割转移后，以手性选择性环糊精柱上的分离图


图 3.7 (续) (b) (iii) 草梅果汁酸乳酪二氯甲烷萃取物在非极性柱上于指定区段进行中心切割转移后的分离色谱图(iv)一中心切割转移后癸烷基（C10），和十二烷基（C12）内酯非外消旋混合物，在进行中心切割转移后，以手性选择性环糊精衍生物柱上的分离图（A. Mosandl, et al. J. High Resol. Chromatogr. 1989,12：532

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