主题：【第六届原创】蔬菜、水果及其制品中吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵、霜霉威、灭多威、霜脲氰残留量的检测方法-超高效液相色谱－质谱/质谱法

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发表于：2011/08/02 13:09:21 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

蔬菜、水果及其制品中吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵、霜霉威、灭多威、霜脲氰残留量的检测方法-超高效液相色谱－质谱/质谱法

唐玉萍

1　范围

本非标方法规定了蔬菜、水果及其制品中吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵、霜霉威、霜脲氰和灭多威残留量的超高效液相色谱-质谱/质谱检测方法。

本非标方法适用于蔬菜、水果及其制品中吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵、霜霉威、霜脲氰和灭多威残留量的检测，该方法在番茄、番茄酱、梨、脱水洋葱等样品中经过验证。

2　规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3　原理

样品用乙酸-甲醇-水溶液提取，C18色谱柱进行分离，用超高效液相色谱-质谱/质谱检测，内标或外标法定量。

4　试剂及材料

除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。

4.1　甲醇：色谱纯。

4.2　乙酸铵。

4.3　10mmol/L乙酸铵：准确称取1.926g乙酸铵，定容至500mL容量瓶中，配制成50mmol/L乙酸铵。用溶剂过滤装置过0.2µm水相滤膜，0～4℃保存，有效期15天。临用时用水稀释成10mmol/L。

4.4　冰乙酸。

4.5　甲醇-水溶液(30+70，V/V)。

4.6　提取液Ⅰ：乙酸-甲醇-水溶液(0.1+50+50，V/V/V)。

4.7　提取液Ⅱ：乙酸-甲醇-水溶液(0.1+80+20，V/V/V)。

4.8　吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵、霜霉威、霜脲氰、灭多威和D4-吡虫啉标准品：均为德国Dr.公司,纯度≥98.0%。

4.9　6种农残标准储备液：分别准确称取吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵、霜霉威、霜脲氰、灭多威标准品10mg～15mg（精确到0.1mg）于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度约为200～300µg/mL的标准储备液，于-18℃避光保存，有效期18个月。

4.10　中间浓度混合标准溶液：根据需要，取适量6种农残标准储备液，用甲醇-水溶液（4.5）稀释配制成2µg/mL的混合标准中间液，0～4℃保存，有效期6个月。

4.11　内标标准储备液：准确称取D4-吡虫啉标准品约10mg（精确到0.1mg）于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度约为200µg/mL的内标标准储备液，于-18℃避光保存，有效期18个月。

4.12　中间浓度内标溶液：取D4-吡虫啉标准储备液，用甲醇-水溶液（4.5）逐级稀释配制成4µg /mL和200ng/mL，0～4℃保存，有效期6个月。

4.13　混合标准工作溶液：准确吸取一定量的中间浓度混合标准溶液（4.10）和中间浓度内标溶液（200 ng/mL），用甲醇-水溶液（4.5）配制成10，20，50，100，200 ng/mL系列浓度的混合标准工作溶液，内标浓度均为20 ng/mL，0～4℃保存，有效期3个月。

4.14　微孔滤膜：0.2µm，有机相。

4.15　流动相过滤滤膜：0.2µm，水相。

5　仪器和设备

5.1　高效液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）：配有电喷雾离子源（ESI）。

5.2　电子分析天平：感量分别为0.1 mg和0.01 g。

5.3　超声波水浴。

5.4　漩涡混合器：3000r/min。

5.5　离心机：9000r/min。

5.6　离心管：聚四氟乙烯，50mL。

5.7　溶剂过滤装置。

6　试样的制备和保存

6.1　试样的制备与保存

取番茄、梨等果蔬样品约500g，将其可食用部分切碎后，用粉碎机粉碎成浆状，混匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的容器中，密封。将试样于-18℃以下冷冻保存。

取番茄酱样品约500g，混匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的容器中，密封。将试样于-18℃以下冷冻保存。

取脱水洋葱样品约200g，混匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的容器中，密封。将试样于0～4℃保存。

注：在制样过程中，应防止样品受到污染或发生农药残留量的变化。

7　测定步骤

7.1　提取

7.1.1　番茄酱、杏酱及浓缩果汁：

称取5g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中，加4µg /mLD4-吡虫啉标准溶液100 mL，加提取液Ⅰ(4.6) 定容至20 mL，2500 r/min 以上旋涡混匀1 min，超声波提取30 min，8500 r/min 离心10 min，取上清液，过0.2 µm 滤膜后，用于液相色谱-串联质谱仪测定。

7.1.2　新鲜番茄、水果及蔬菜：

称取10g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中，加4µg /mLD4-吡虫啉标准溶液100 mL，加提取液Ⅱ(4.7) 定容至20 mL，其余提取步骤同7.1.1。

7.1.3　脱水番茄、番茄粉及其他脱水蔬菜：

称取1g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中，加4µg /mLD4-吡虫啉标准溶液100 mL，加10mL水涡旋混匀，浸泡2小时，加提取液Ⅱ (4.7) 定容至20 mL，其余提取步骤同7.1.1。

7.2　液相色谱-质谱测定

7.2.1　高效液相色谱条件

a) 色谱柱：BEH C18, 1.7 mm, 2.1 mm×50 mm或相当者；

b) 流动相：A：10mmol/L乙酸铵，B：甲醇。梯度见表1；

c) 流速：0.25 mL/min；

d) 柱温：40 ℃；

e) 进样量：5 mL。

表1 液相色谱流动相洗脱梯度

时间(min)	A%	B%
0	90.0	10.0
3.0	10.0	90.0
4.0	10.0	90.0
4.5	90.0	10.0
6.5	90.0	10.0

7.2.2　质谱条件

a) 电离方式：ESI+；

b) 检测方式：MRM；

c) 毛细管电压：3.0 kV；

d) 氮吹气流量：550L/h；

e) 锥孔气流量：90 L/h；

f) 去溶剂气温度：400 ℃；

g) 放大器电压：650 V；

h) 离子源温度：110 ℃；

i) 监测离子对、碰撞气能量和锥孔电压见表2。

表2 监测离子对、碰撞气能量和锥孔电压

被测物名称及内标名称	定性离子对（m/z）	定量离子对（m/z）	驻留时间（s）	碰撞能量 (eV)	锥孔电压 (V)
吡虫啉	256.2>175.0	256.2>175.0	0.10	18	30
吡虫啉	256.2>209.0	256.2>175.0	0.10	15	30
多菌灵	191.7>159.7	191.7>159.7	0.10	18	27
多菌灵	191.7>131.7	191.7>159.7	0.10	30	27
甲基硫菌灵	343.0>150.9	343.0>150.9	0.20	20	25
甲基硫菌灵	343.0>310.8	343.0>150.9	0.20	11	25
霜霉威	189.1>101.8	189.1>101.8	0.15	17	25
霜霉威	189.1>143.9	189.1>101.8	0.15	12	25
霜脲氰	198.9>127.9	198.9>127.9	0.10	8	20
霜脲氰	198.9>111.0	198.9>127.9	0.10	18	20
灭多威	163.0>87.9	163.0>87.9	0.15	9	16
灭多威	163.0>106.0	163.0>87.9	0.15	10	16
D4-吡虫啉	260.2>179.1	260.2>179.1	0.10	20	25

7.2.3　液相色谱-串联质谱测定

7.2.3.1　定性测定

每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度/%	＞50	＞20~50	＞10~20	≤10
允许的最大偏差/%	±20	±25	±30	±50

7.2.3.2　定量测定

在仪器最佳工作条件下，对混合标准工作溶液（4.13）及测试样品等体积参插进样，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，吡虫啉的测定以标准溶液中其峰面积和D4-吡虫啉峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中其浓度与D4-吡虫啉浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，内标法定量。其余5种农残用外标法定量。6种农残和D4-吡虫啉的多反应监测（MRM）色谱图参见附录A。

7.3　空白实验

除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。计算结果将空白值扣除。

8　结果计算

用数据处理软件或按照式（1）计算：

…………………………… （1）

式中：

X——试样中被测物残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c_s——标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

A——试样溶液中被测物的色谱峰面积；

A_s——标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；

c_i——试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）;

c_si——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）;

A_si——标准工作溶液中内标物的色谱峰面积;

A_i——试样溶液中内标物的色谱峰面积;

V——样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；

m——样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。

注：计算结果应扣除空白值。

9　方法的测定低限、回收率

9.1　测定低限

本方法中，番茄酱类样品6种农残的测定低限（LOQ）均为0.02mg/kg；新鲜果蔬类样品6种农残的测定低限（LOQ）均为0.01mg/kg；脱水蔬菜类样品6种农残的测定低限（LOQ）均为0.1mg/kg。

9.2　回收率

本方法中吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵、霜霉威、霜脲氰和灭多威在番茄酱基质中0.02mg/kg的添加回收结果为：

吡虫啉：回收率为100%-114%，相对标准偏差为5%；

多菌灵：回收率为79%-108%，相对标准偏差为12%；

甲基硫菌灵：回收率为85%-112%，相对标准偏差为9%；

霜霉威：回收率为72%-100%，相对标准偏差为15%；

霜脲氰：回收率为44%-60%，相对标准偏差为13%；

灭多威：回收率为37%-52%，相对标准偏差为13%。

10　允许差

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15% 。

附件：

蔬菜、水果及其制品中吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵、霜霉威、灭多威、霜脲氰残留量的质谱法.doc