快速导航采购仪器提醒

生命科学仪器综合讨论

版主:

入住本版

专家:

仪器信息网

居民列表

仪器社区 > 生命科学仪器 > 生命科学仪器综合讨论帖子详情

快速回复发表新帖最新帖

返回列表

主题：【转帖】超声波破碎细胞的常见问题

浏览0 回复1 电梯直达

省部重点实验室

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

发表于：2012/05/03 12:35:16 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较

好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。

细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步

骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即

可)在微波炉煮10min 就可以。

在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响

了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。

1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。功

率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。

2*破3S停10S，破个二三十次看看。

3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。在破碎时

试着加大体积,强度最好不要超过60%.

4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一

些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。

链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？

前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。

使用超声破碎时采用的具体条件是：

(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．

(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40

mL大塑料试管内．

(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．

(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．

超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就

可以。另外，超声剂量随样品量、菌体改变比较大，功率可以到400－600w，超5s，停5s，冰浴，要加终

浓度1 mM的PMSF。为确定合适的超声强度和次数，有必要随时镜检观察菌体是否完全破碎。

放线菌属于原核生物系统进化树上的（G＋C）摩尔百分含量（mol％）高的革兰氏阳性菌

（Eubacteria）分枝类群，它虽然具有原核生物特有的分子生物学特性，但在其不同类群中，细胞壁的化学

组分变化很大。

在做大肠杆菌超声时，采用的是400W，超5停5的方法，效果不错，但是用在链霉菌上，似乎没什么效

果。会不会就是由于细胞壁组成差异造成的呢，因为大肠杆菌式属于革兰氏阴性菌的。

再有镜检是检验破碎效果,但是细胞破碎程度和我需要的酶获得之间有正比关系吗？破碎时间长也会影响到

酶的活性。所以想问问anaisai战友，你提供的“功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S”的条

件好像是用于破碎链霉菌孢子的，也可以用于发酵离心后的菌泥吗？如果可以，你破碎的全程时间大概是多

少呢？

如果你需要的是胞内酶，细胞破碎程度和需要的酶获得之间基本上有正比关系。破碎时间长的确会影响到

酶的活性。这就需要在最佳的破碎时间和酶活性之间做出判断，最直接的办法是先绘制相关曲线（酶活性和

时间的关系曲线）。

实验中，破碎的是棒状杆菌（也是很难破壁的G+菌），破碎时间控制在30min左右，酶活较好。

该帖子作者被版主 zhang8826857加 3积分， 2经验，加分理由：欢迎常常发帖交流^_^

0
赞贴
1
回帖
0
收藏
0
拍砖
版主
招募

为您推荐

近期热榜

热门活动

您可能想找: 气相色谱仪(GC) 询底价

选参数看心得找厂商查方案

专属顾问快速对接

立即提交

可能感兴趣

省部重点实验室

禁止发帖修改昵称

ID：gl19860312

行业：其他

积分：0升级还需100积分

声望：0升级还需100声望

注册时间：0000-00-00

最后登录时间：0000-00-00

进入iLog 私信关注

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

2012/5/3 12:35:35 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

如果是基质菌丝的话,好可以考虑用溶菌酶处理一下.

一般来讲这几种方法读可以的:

一,液氮研磨

二,用french press破碎

三，超声波破碎

四，溶菌酶处理预处理

超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它既是一种波动形式,又是一种能量形式。超声对细胞的作用主要

有热效应，空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，

使部分能量转化为局部高热（42－43℃）。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和

其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。另外，空化泡破裂时产生瞬时高温（约5000℃）、高压（可达

500×104Pa），可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应

可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应，超声波在传播过程中介

质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化，引起细胞结构损伤。损伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相

关。

100g大肠杆菌溶于1L破碎液里（破碎掖：50mM Tris-Cl(PH8.5) 5mM EDTA 0.14M NaCl），搅

拌，发现菌液发粘，菌体不能够很好分散，用高压匀质机破碎，加压后，菌液不能进入匀质机，速度很慢，

请问是何原因？能有好的办法解决，很好用匀质机快速破碎菌体？

将破碎液的量加大，不能很好分散可能是量太大。超声处理5－10分钟，菌液粘度即可大大降低，也可促进

菌体分散。
不同型号的设备功率不一样，功率的大小决定了使用变幅杆的大小范围（直径2mm至几十毫米），你使

用多大的变幅杆就在设备的上调至该刻度（很简单的）！变幅杆的大小决定了处理量5ml一下选3mm，5～

50ml可选6～8mm，50ml以上选10mm的变幅杆，依此类推！占空比不用关心的，主要是指超声时间和停

顿时间的比值。

酵母破碎的问题

一般的PROTOCOL都是用glass beads 破碎酵母细胞sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做过的方

法中还是玻璃珠，效率很高，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。

化学裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的

加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值

8.0），据说效果可以。

毕氏酵母细胞破碎法

在破碎遇到的问题是菌体浓度太低，OD620nm在4-6之间。细胞破碎仪的最低破碎体积为4ml左右，这

样再稀释一倍，OD就到2-3啦，我们怀疑破碎完溶出蛋白和酶活测定时会测不准。所以请教大家细胞破碎时

最低的菌浓多少为下限？我们的菌是一种棒杆菌。破碎后，你可将液体放入透析袋中浓缩。

我们所做的方法是按照1：20的比例将离心后的菌体（e.coli）溶解于超声缓冲液（50mM 磷酸 pH

8.0 ）300w 10s/10s 破碎20分钟。做了镜检！基本全被破碎了！我做蛋白纯化的，做的包涵体。实验中

我们的菌体浓度相对独立，与培养液中的菌体od无关，不收其限制，便于操作者调控。

一般按每g湿菌体加5-10ml裂菌缓冲液。

超声肯定会产热，所以一定要有降温装置，除非你需要得成分耐高温。

赞贴

拍砖