主题：【第十一届原创】QuEChERs/超高效液相色谱-串联质谱法测定果蔬中74种农药残留量

摘 要：建立同时测定果蔬中74种农药的QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的分析方法。样品经乙腈提取，经氯化钠盐析分层，上清液经PSA、石墨炭黑（gcB）、C18混合净化剂净化，经C18色谱柱分离，用含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈梯度洗脱，多反应监测(MRM)正离子模式扫描，外标法定量。74种农药在0.0020 ～0.050 mg/L的浓度范围内呈良好线性关系，其相关系数（r）不小于0.99。方法的定量下限为0.010mg/kg，在 0.020，0.050，0.10 mg/kg的加标水平下，平均回收率在64％～104%之间，测定结果的相对标准偏差小于11%(n=6)。该方法操作简单、快速、灵敏度高，适用于大批量果蔬样品中农药多残留的快速分析。
关键词： QuEChERS；农药多残留；溶剂效应
    农药多残留的检测方法一般是气相色谱-串联质谱法（gc-MS/MS）或液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。由于被使用的农药的种类繁多和一次进样实现复杂样品中上百种农药的高灵敏度检测的要求，所以上述两种技术常被采用。气质联用法用于弱极性同时具有一定挥发性农药的分析，而液质联用法则适合于极性或者热不稳定的农药分析，有不少农药是属于既适合气质分析又适合液质联用技术分析的化合物。并且近年来高效、低毒、低残留农药品种不断涌现和越来越多非挥发性农药的研发使用，这类农药残留的分析大多数适合液质分析。而液质联用法极大地提高了选择性，并具备丰富的定性和定量信息、优异的灵敏度，扩大了对有机分子的适用性。因此液质联用法已经成为农药多残留检测的主要手段。
    随着色谱设备和色谱柱技术上的显著进步，UPLC（超高效液相色谱）、RRLC（高分离度快速液相色谱）、UFLC（快速液相色谱）等作为一种快速分析技术，与传统的HPLC相比，不仅分离度、分离速度和灵敏度显著提高，显著缩短了分析时间，提高分析通量，而且很大程度上减少了试剂和样品的消耗量。从2004以来，无数的检测机构采用UPLC技术作为日常分析平台，取代常规HPLC。
    目前,我国国家标准GB/T20769-2008提供了水果和蔬菜中农药残留量分析的液相色谱-串联质谱检测方法，但该方法前处理操作繁琐、费时费力、成本高，不适合大批量样品的快速定性及定量分析。QuEChERS方法是一种快速、简单、廉价、高效、耐用、安全的样品前处理方法,适合多种样品基质及农药种类，已广泛用于食品中农药残留量的检测，但是QuEChERS方法在结合液相色谱-串联质谱仪分析时由于样品稀释倍数的变化会造成比较严重的溶剂效应，而关于溶剂效应对分析结果的影响报道较少。因此，本试验选择了农业部农产品质量安全蔬菜和水果例行监测参数中适合液相色谱-串联质谱法分析的74种农药，在传统的QuEChERS方法的基础上，通过改变盐析试剂种类，降低了检测成本，并通过对提取溶剂体积的优化，提高了方法的适用性，同时对溶剂效应的影响因素进行了较为深入的研究，并结合超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪（UPLC-MS/MS）, 建立了一次进样即可测定果蔬样品中74种农药残留量的方法。该方法操作简便、快速、灵敏度高、结果准确可靠，可用于大批量样品的快速定性及定量分析。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
    超高效液相色谱仪：Waters ACUQITY UPLC型，美国沃特世公司；三重四级杆质谱仪：ABSCIEX Triple Quad™ 5500型，配电喷雾离子源（ESI），MultiQuant数据处理系统，美国应用生物系统公司；乙腈：HPLC级，德国Merck公司；乙酸铵：优级纯，美国MREDA；水：Millipore超纯水机制备得到；PSA粉、C₁₈及石墨炭黑粉：美国安捷伦科技公司；74种农药标准溶液：浓度均为100mg/L，农业部环境保护科研监测所。
1.2色谱条件
    色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱（  100mm ×2.1 mm，1.7μm）；进样量：5μL ； 流动相A：含 0.1% 甲酸的5mmol/L乙酸铵水溶液  B:乙腈；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0～0.25 min，10% B；0.25～7.75min，98% B；7.75～8.5 min，98% B；8.51～10min，10% B；柱温：30℃。
1.3质谱条件
    ESI离子源温度：550℃；喷雾电压(正离子)：5500 V；喷雾电压(负离子)：-4500 V；气帘气(氮气)压力:207kPa(30 psi)；雾化气(氮气)压力:483 kPa (70 psi)；辅助雾化气(氮气)压力:414 kPa (60 psi)；s-MRM设置条件为40 s的时间监测窗口，通过软件自动优化各化合物MRM的驻留时间；其它质谱参数见表1。

表1  74种农药的离子对信息、去簇电压、碰撞能量、回归方程、相关系数、平均回收率、平均RSD

NR.	Compound	MRM	DP／V	CE／eV	回归方程	r	平均回收率／%   %	RSD   %
1	多菌灵	192/160*,192/132	80	25,41	Y=4.21331e5x+19878	0.9997	104	5.8
2	啶虫脒	223126*，22399	70	27,47	Y=3.52241e5x+31480	0.9996	84	4.9
3	吡虫啉	256.1/209*，256.1/175	60	23,26	Y=5.63120e5x+819.37	0.9992	78	3.5
4	毒死蜱	350/97*,350/198	82	49,29	Y=3.2793e4x+16016	0.9998	96	7.3
5	噻虫嗪	292/211*，292/181	60	18,32	Y=1.0864e5x+8668.7	0.9994	99	5.3
6	烯酰吗啉	388.1/301*，388.1/165	115	29,43	Y=3.66494e5x+318832	0.9998	85	3.7
7	苯醚甲环唑	406.1/251*，406.1/337	120	37,23	Y=2.43759e5x+121735	0.9999	92	9.3
8	三唑磷	314/162*，314/119.1	70	25,47	Y=6.89186e5x+1.16 e6	0.9993	88	4.7
9	丙溴磷	373/302.9*，373/345.2	80	25,18	Y=8.5170e4x+16201	0.9992	88	5.3
10	二甲戊灵	282.1/212*，282.1/194	45	15,25	Y=5.6503e4x+35524	0.9991	81	4.8
11	克百威	222.1/165*，222.1/123.1	70	17,29	Y=4.60761e5x+33491	0.9996	94	4.2
12	辛硫磷	299.1/77*，299.1/129	67	46,16	Y=7.6519e4x+31882	0.9995	84	8.9
13	敌百虫	274/109*，274/220.9	32	25,22	Y=15059x+140.33	0.9991	96	4.7
14	氧乐果	214/182.9*，214/109	56	16,36	Y=1.7160e5x+57285	0.9999	74	7.6
15	甲基异柳磷	273/231*，273/121.1	39	13,33	Y=1.65694e5x+3968.4	0.9995	93	4.2
16	敌敌畏	221/109*，221/127	70	23,25	Y=3.45472e4x+11761	0.9993	85	4.0
17	甲胺磷	142/94*，142/125	54	19,18	Y=4.99043e4x+8035.4	0.9998	87	4.1
18	灭多威	163/88*，163/106	38	13,13	Y=1.0035e4x+46553	0.9993	78	9.5
19	乙酰甲胺磷	184/143*，184/125	50	10,26	Y=5.3059e4x+16464	0.9990	90	7.5
20	嘧霉胺	200/107*，200/82	91	34,37	Y=1.36152e5x+68183	0.9993	93	8.0
21	甲萘威	202.1/145*，202.1/127	54	15,40	Y=1.61585e5x+22074	0.9997	84	3.5
22	涕灭威亚砜	207/132*，207/89	51	10,20	Y=5.23875e4x+1122.8	0.9998	79	4.0
23	涕灭威	116.1/89*，116.1/70	47	10,10	Y=5.45728e4x+14032	0.9999	68	6.6
24	乐果	230/199*，230/125	56	13,29	Y=2.60267e5x+36450	0.9994	90	5.8
25	三羟基克百威	238/181*，238/163	65	14,20	Y=8.3708e4x+31644	0.9990	92	7.2
26	涕灭威砜	223/148*，223/76.1	63	12,10	Y=3.5918e4x+7798.2	0.9991	86	8.1
27	甲拌磷	261.1/75.2*，261.1/199	34	14,11	Y=13667.48x+5570.4	0.9990	83	10.0
28	甲基对硫磷	264/124.9*，264/231.9	65	23,23	Y=426.70x+149.04	0.9994	79	9.3
29	杀螟松	278/125*，278/246	52	25,22	Y=1151.56x+376.29	0.9997	77	4.4
30	倍硫磷	279.1/169*，279.1/247	78	23,18	Y=4.05531e4x+22060	0.9995	80	7.4
31	水胺硫磷	273.1/231*，273.1/121	67	15,32	Y=1.35108e5x+17515	0.9996	90	3.9
32	对硫磷	292/236*，292/264	80	20,15	Y=9519.32x+3908.53	0.9993	84	5.2
33	二嗪农	305/169*，305/153	80	27,28	Y=3.53638e5x+25098	0.9994	90	4.6
34	亚胺硫磷	318/160*，318/133	38	16,49	Y=1.39617e5x+11725	0.9998	88	9.3
35	马拉硫磷	331/127*，331/285	64	17,13	Y=1.90496e5x+101949	0.9998	89	6.1
36	哒螨灵	365/309*，365147	110	17,31	Y=2.42011e5x+42470	0.9993	90	4.0
37	伏杀磷	368/182*，368/322	71	20,13	Y=7.29557e4x+37308	0.9991	90	8.4
38	嘧菌酯	404.1/372*，404.1/344.1	70	20,34	Y=5.55921e5x+553243	0.9997	91	6.3
39	特丁硫磷	289.1/103.1*，289.1/233.2	44	8,13	Y=10136.9x+3566.2	0.9994	82	5.9
40	蝇毒磷	363/227*，363/307	100	36,25	Y=8.9567e4x+43646	0.9993	92	4.4
41	治螟磷	323/171.1*，323/115	70	21,43	Y=1.87991e5x+2772.2	0.9992	88	3.8
42	久效磷	224.1/127*，224.1/98	71	21,17	Y=2.01183e5x+130810	0.9995	88	8.1
43	磷铵	300/174*，300/126.9	75	19,36	Y=4.21331e5x+19878	0.9998	92	9.7
44	甲基硫菌灵	343/151*，343/192	78	28,23	Y=2.81587e5x+60556	0.9996	89	3.1
45	乙草胺	270.2/133.1*，270.2/148.2	36	45,15	Y=11615.7x+1796.5	0.9991	85	6.8
46	杀扑磷	303/145*，303/85	56	13,28	Y=7.24715e4x+402.87	0.9997	88	9.2
47	灭线磷	243/97*，243/131	51	41,29	Y=2.72709e5x+37187	0.9994	91	6.9
48	腐霉利	284.1/256*，284.1/145.1	21	23,61	Y=501.04x+290.05	0.9980	79	7.6
49	氟虫腈	435.1/330*，435.1/250	-96	-23,-37	Y=251.70x+184.04	0.9998	68	4.8
50	异菌脲	330.1/245*，330.1/288	50	21,18	Y=3073.7x+1781.4	0.9990	84	10.4
51	咪鲜胺	376.2/308*，376.2/70.1	65	17,43	Y=1.68100e5x+59725	0.9990	88	6.3
52	氟啶脲	540/383*，540/158	80	27,24	Y=54060.8x+20380	0.9998	90	4.5
53	阿维菌素	895.4/751.3*895.4/449.2	120	60,60	Y=173.598x+184.07	0.9996	80	5.6
54	除虫脲	311/158*，311/141.2	72	21,47	Y8.10529e4x+38333	0.9991	78	7.1
55	灭幼脲	309/156*，309/139	75	20,44	Y=6.6032e5x+6740.1	0.9997	77	5.9
56	甲维盐   （甲氨基阿维菌素苯甲酸盐）	886.5/158.1*886.5/302.1	120	37,39	Y=1.63492e5x+129484	0.9992	89	9.0
57	三唑酮	294/197*，294/225	81	21,17	Y=9.51204e4x+15650	0.9990	80	4.2
58	甲拌磷砜	293/171*,293/143	55	15,25	Y=1.65e4x+50300	0.9995	79	5.5
59	甲拌磷亚砜	277/143*,277/199	55	15,25	Y=4.87e4x+41300	0.9999	75	9.5
60	特丁硫磷砜	321/170.9*,321/115	108	18,38	Y=2.88e5x+89700	0.9998	81	8.5
61	特丁硫磷亚砜	305/187*,305/131	87	15,37	Y=4.67e4x+4225	0.9999	73	9.6
62	氟虫腈砜	451/415*,451/282	-114	-23,-36	Y=1.47e5x+20048	0.9999	64	4.5
63	氟甲腈	387/351*,387/282	-117	-20,-42	Y=1.21e5x+897	0.9999	71	7.8
64	氟虫腈硫醚	418.9/383*,418.9/262	-109	-18,-37	Y=1.01e5x+4114	0.9999	73	10.2
65	甲氰菊酯	350.2/97.1*,350.2/125.1	71	43,15	Y=3.44e4x+4487	0.9999	89	9.9
66	联苯菊酯	350.2/181.1*,350.2/166.2	40	18,56	Y=353x+124	0.9998	92	8.7
67	虫酰肼	353.1/133.1*,353.1/297.1	56	23,15	Y=1.97e5x+20271	0.9999	85	5.6
68	霜霉威	189/102*,189/74	56	24,34	Y=5.34e5x+59300	0.9987	77	8.5
69	甲霜灵	280.2/220*,280.2/192.3	35	18,24	Y=4.28e5x+18600	0.9997	71	9.1
70	氯吡脲	248.1/129*,248.1/93	60	24,48	Y=1.079e5x+19580	0.9999	75	5.9
71	多效唑	294/70*,294/125	90	50,55	Y=1.048e5x+11304	0.9999	68	4.9
72	灭蝇胺	167.1/85*,167.1/125	56	23,15	Y=1.186e5x+14400	0.9990	64	7.2
73	氯虫苯甲酰胺	484/286.1*,484/453.1	127	19,24	Y=25247x+1331	0.9999	70	4.5
74	吡唑醚菌酯	388.1/194*,388.1/163	50	18,36	Y=2.30e5x+29614	0.9999	79	8.2

注：母离子与带*的离子组成定量离子对。
1.4实验方法
    准确称取10.0 g试样于50mL离心管中，加入15 mL乙腈、2-4g氯化钠，高速匀浆2 min，离心5分钟（8000r/min），然后取1 mL提取液加入装有分散固相萃取填料（25 mg PSA、150mg MgSO4和2.5mg gcB）的离心管中，拧紧盖并且振荡1 min，离心5min（5000 r/min），取上层有机相300μL，加入700μL含0.1%甲酸的水溶液，混匀后过0.22μm滤膜后进样分析。
2、结果与讨论
2.1 提取溶剂及体积的选择
    对比了乙腈和含1%乙酸的乙腈溶液作为提取溶剂对74种农药的提取效率。实验发现，用1%的乙酸乙腈比用乙腈提取的杂质多，因此在净化时PSA、C18和gcB等填料的加入量需要大一些，但对74种农药的提取效率无明显差异。考虑节约成本，实验选择乙腈作为提取溶剂。
传统的QuEChERS方法中常用无水硫酸镁除水。实验过程中发现，无水硫酸镁在吸水过程中放热剧烈，会使离心管温度升高很多，产生的热量会导致一些易挥发的农药回收率降低，形成的热气流有可能将离心管盖冲开，因此在振摇的过程需要打开离心管盖放气。而氯化钠作为盐析试剂操作简单、回收率高、成本低。因此实验选择氯化钠作为盐析试剂。
    QuEChERS 方法中样品质量和提取溶剂体积的比例为1:1，而GB/T20769-2008和NY/T761-2008等标准中其比例均为1:2。本实验对比了用10，15，20mL溶剂对10g样品中74种农药的提取效率。实验发现，当提取溶剂提取为10mL时，匀浆提取法的提取效果不理想，回收率较低。当提取溶剂体积为15mL或20mL时回收率有显著提高。考虑到样品的稀释倍数及残留限量的规定，最终确定提取溶剂的体积为15mL。
2.2净化条件选择
    水果和蔬菜等样品基质中含有较多的有机酸、糖类、维生素及脂肪等物质，这些物质在提取过程中会与待测组分一并提取出来。若不进一步净化，基质效应带来的干扰会影响检测结果的准确性。QuEChERS法常用的吸附剂有PSA、C₁₈及石墨炭黑（gcB）等，可实现对基质中色素、有机酸、脂肪酸和强阴离子等多种物质的净化。其中PSA去除脂肪酸效果较好，而C18 对油脂的去除效果非常显著，还可以除去一些非极性的杂质，但是对倍硫磷有较强的吸附。石墨炭黑去除维生素、色素、甾醇能力较好,但对平面结构分子（如多菌灵、咪鲜胺、嘧霉胺、亚胺硫磷、伏杀磷和部分氨基甲酸酯类农药）具有很强的亲和性，因此净化时在石墨炭黑的使用上要谨慎。这几种吸附剂的混合使用能够显著的改善净化效果，因此实验选择PSA、石墨炭黑(gcB)、C₁₈混合净化剂。
2.3定容溶液的确定
    国家标准GB/T20769-2008和QuEChERS方法在进样前都是经乙腈-水溶液复溶或用水稀释净化液，而定容液中乙腈的比例会对色谱峰峰形及化合物灵敏度造成影响。因此试验对比了乙腈体积分数为10%，30%，50%，70%的定容溶液对74种农药色谱峰峰形及灵敏度的影响。通过对试验结果的分析，发现对于保留时间在3 min以内的农药，当定容液中乙腈比例超过50%时，色谱峰保留时间都有不同程度的提前，同时峰宽平均增加0.1 min，色谱峰分裂，甚至出现双峰，结果见图1-3。对于保留时间3 min以后的化合物，无论定容液中乙腈比例是多少，溶剂效应基本上都不存在了，色谱峰宽、保留时间均没有明显变化，结果见图4-6。

    通过MultiQuant数据处理系统计算了浓度为0.010mg/L的74种农药在4种不同乙腈比例定溶液下的信噪比。随着乙腈比例的增加，信噪比浮动在10%内的化合物有啶虫脒等28种农药；信噪比增加超过10%并且小于50%的化合物有氟啶脲等11种农药；信噪比增加超过50%的有乙酰甲胺磷等17种农药，其中氟啶脲、毒死蜱、哒螨灵信噪比增加超过10倍；信噪比减小幅度小于50%的有三羟基克百威等10种农药；信噪比减小幅度大于50%的有涕灭威砜等8种农药。

    通过实验得出，信噪比随着有机相比例升高而降低的化合物其保留时间均小于3 min，说明色谱峰由于受到溶剂效应影响出现展宽、峰高降低，导致信噪比降低。这就意味着，对于液相色谱来说，当被测物谱带变宽，最终色谱峰宽响应变宽，较宽的样品谱带产生稀释效应，将降低峰高，同时伴随灵敏度和分离度的降低。与之相反，流动相线速度更高，整个被测物分子将在较短时间内通过色谱柱，这样被测物谱带将保持集中，由于纵向扩散时间短，较高浓度的谱带具有较高的灵敏度和分离度，峰更高、更窄、效率更高。
    因此，考虑到定容液中乙腈比例对74种农药色谱峰峰形和灵敏度的影响，最终选择30%乙腈-水溶液作为定容液。
2.4色谱-质谱条件的优化
    实验采用梯度洗脱，考察了乙腈-水及甲醇-水两种流动相体系的分离效果，发现在2种流动相体系下各组分分离效果、灵敏度并没有显著差异，但考虑到前处理过程中提取溶剂为乙腈，为保持一致，最终确定以乙腈-水作为流动相。由于74种农药的质谱电离方式均为正离子模式，在流动相中加入0.1%甲酸和5mmol/L乙酸铵后，多个农药的响应值得到提高，同时改善了色谱峰峰形。因此，本实验最终选择含0.1% 甲酸的5mM乙酸铵水溶液-乙腈作为流动相。
74种农药在ESI正离子模式下，采用注射泵连续进样模式进行质谱条件优化，确定了各化合物的去簇电压、碰撞能量、离子源温度、去溶剂气温度及流量、碰撞气流量及定性定量离子等质谱参数，使样品液中每种农药的离子化效率达到最佳，优化得到的质谱条件见表1。
2.5 基质效应
  基质效应是质谱检测中普遍存在的现象，液质联用法的基质效应一般表现为基质抑制。基质效应的消除有如下方法：⑴在前处理时尽量将样品处理干净；⑵在仪器分析时采用基质匹配标准溶液做校准曲线；⑶采用同位素内标法校正；⑷稀释样品溶液。对于农药多残留分析来说，采用同位素内标法不现实，而采用基质匹配标准溶液做校准曲线虽然能在一定程度上消除基质效应，但是在批量的检测过程中，由于果蔬产品种类众多，很难做到每一种基质都去匹配标准溶液做校准曲线，因而本实验采用稀释的方法对样品溶液进行了5倍稀释，降低了基质效应的干扰。
2.6方法学验证
2.6.1线性范围和定量下限
    将74种农药的混合标准溶液用 甘蓝、黄瓜和毛桃空白基质配成2、5、10、20、50μg/L的系列混合基质标准溶液，按1.2、1.3仪器工作条件下进行LC-MS/MS测定，以峰面积（y）对溶液中各组分的质量浓度（x）绘制标准曲线。结果表明，74种农药的浓度在2~50μg/L的范围内，其响应值与质量浓度均成良好线性关系，相关系数（r）均高于0.99。各农药在甘蓝基质中的回归方程及相关系数见表2。
通过加标实验，根据信噪比（S/N）≥10的峰响应及样品前处理的稀释倍数，结合国家标准GB2763-2016中对水果和蔬菜中这74种农药的残留限量的规定，确定了74种农药的定量下限均0.010mg/kg。
2.6.2 方法的回收率和精密度 试验
    试验用空白甘蓝、黄瓜及毛桃做基质进行加标回收率和精密度试验，以定量限浓度、 2倍定量限浓度和5倍定量限浓度作为低、中、高3个添加水平进行回收率实验。添加了农药混合标准溶液的样品静置30分钟后，使农药被样品充分吸收后，按照1.2、1.3和1.4节方法进行前处理和测定，每个水平重复6次。74种农药的平均回收率为 64％～104％，相对标准偏差小于11％（见表1）。
3、结论
    本文优化了QuEChERS方法对果蔬样品的前处理方法，结合超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪（UPLC-MS/MS），建立了水果和蔬菜中74种农药残留量的检测方法。方法简便、快速，能够在10分钟内完成74种农药的有效分离，同时具有较好的灵敏度、准确度和精密度，能够满足果蔬中农药残留限量的检测要求，适合大批量果蔬样品中多种农药残留的定性和定量分析。