客户要求参考《GB 5009.86-2016 食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》的测定方法，筛选合适的色谱柱，要求使L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸的分离度大于0.90，且保留稳定。
首先，尝试使用CAPCELL PAK C₁₈MGII S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm色谱柱，按照《GB 5009.86-2016 食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》方法，对L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸混合样品进行分析，实验中发现，随着色谱柱平衡时间的延长，L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸峰保留时间逐渐向后移动，并且两个峰逐渐合成一个峰，如图1所示。

图1 混合样品分析色谱图（平衡时间延长）

由于标准方法中流动相含有离子对试剂（十六烷基三甲基溴化铵），因此我们需要对色谱柱进行充分的平衡，以得到相对稳定的保留时间。连续对色谱柱平衡约48小时后，待测物保留时间为10.33min，保留时间稳定，但两个色谱峰重合，三针重复性结果如图2所示。

图2 混合样品分析色谱图（三针重复性）

尝试在原条件基础上提高流动相中有机相比例，以期得到二者分离。如图3，当流动相中含有25%CH₃OH时，L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸峰分离效果最好，分离度为0.95，但峰形略差。

图3 混合样品分析色谱图（调节有机相比例）

为改善峰形，尝试将柱温由25°C提高到30°C，结果如图4所示。L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸峰形得到明显改善，二者分离度为1.28，大于客户要求的0.90。我们也尝试进一步提高流动相中有机相比例、温度以及改变有机相种类，未得到更好的分析结果。

图4 混合样品分析色谱图（25%CH3OH 30°C）

此外，我们还尝试使用保留能力较MGII稍弱的CAPCELL PAK C₁₈ UG120 S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm色谱柱，经流动相充分平衡后，在同样条件下对L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸混合溶液进行分析，也未得到更好的分离结果。

上述实验中，我们在原条件基础上将流动相中有机相比例及柱温调整为25%CH₃OH、30°C，使用MGII色谱柱进行分析，可得到L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸分离度为1.28的最佳分离结果，但二者仍未达到基线分离。且使用添加离子对试剂的流动相进行分析时，色谱柱需要2天左右的平衡时间，因此，我们也开发了不含离子对试剂的分析条件。

在流动相为20mM NH₄H₂PO₄(pH2.0) / CH₃OH = 98 / 2的酸性条件下，分别使用键合金刚烷基的高极性色谱柱CAPCELL PAK ADME S5、在纯水条件下也能稳定使用的高极性色谱柱CAPCELL PAK C₁₈ AQ S3，以及之前实验中使用的CAPCELL PAK C₁₈ MGII S5，对L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸混合溶液进行分析。结果如图5所示，三款色谱柱对L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸均可得到基线分离的良好结果，且峰形良好，分离度分别为1.89、2.05、2.10。

图5 混合样品分析色谱图（三款色谱柱对比）

在此条件下使用ADME色谱柱进行精密度及线性实验的考察。精密度实验结果如表1所示，连续进样六针，L(+)-抗坏血酸峰面积RSD为0.32%、D(-)-异抗坏血酸峰面积RSD为0.25%。线性实验结果如图6、7所示，在0~50 μg/mL的浓度范围内，L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸均呈现良好的线性关系。

表1 抗坏血酸精密度实验

图6 抗坏血酸线性试验（L(+)-抗坏血酸）

图7 抗坏血酸线性试验（D(-)-异抗坏血酸）

综上，在不添加离子对试剂的酸性条件下，使用键合金刚烷基的ADME色谱柱及MGII、AQ S3两款C₁₈色谱柱进行分析，均可对L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸得到基线分离的良好结果。

此外，在实验中我们发现使用流动相（20mM NH₄H₂PO₄(pH2.0) / CH₃OH= 98 / 2）作为样品溶剂时，随着分析时间的延长，L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸的峰面积有逐渐减小趋势；而当样品溶剂为20 g/L的偏磷酸时，L(+)-抗坏血酸、D(-)-异抗坏血酸峰面积基本保持稳定，但死时间处的溶剂峰较大。